一株高产乙偶姻细菌的选育与生产的制作方法

一株高产乙偶姻细菌的选育与生产，属于生物工程领域。
背景技术：
：乙偶姻又称为3-羟基-2-丁酮(acetoin)，具有明显的脂香特征，是一种被大众广泛使用的食用香料，经常添加到奶油、乳品、酸奶的制作中，并作为干酪、咖啡、坚果的香味增强剂；在酿酒行业中，80%含量的乙偶姻俗称“醋嗡”，可作酒类调香中的重要品种；在制药行业，乙偶姻可用于药物的合成，如乙偶姻可用以合成医药中间体4-氯-4,5-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-2-酮（cdmdo）[3]，从而提高药效，减轻药物的副作用；在烟草行业，乙偶姻、1-戊烯-3-醇等物质具有典型的香气特征，是特香型烤烟中特殊香气的主要物质[4]；此外，在it行业中，具有光学活性的乙偶姻衍生物可作为液晶材料的重要成分[5]。同时，乙偶姻作为一种平台化合物广泛应用于其他行业，2004年，美国能源部将其定义为30种优先利用的平台化合物之一[6]。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高产乙偶姻菌株的筛选方法以及利益该菌株生产乙偶姻。本发明的技术方案。1、在高产乙偶姻细菌的筛选方法。在果树下用小铲挖取表面约3cm厚的土壤，取土样大约50g，装入小烧杯保存。富集培养：取10g土壤溶解于90ml无菌水中制成悬液，以此菌悬液作为母液梯度稀释至10-8，取10-6、10-7、10-8的稀释菌悬液接种于lb液体培养基，在37℃、150r/min的摇床上培养12-24h。菌株初筛：将富集得到的菌液梯度稀释至10-8，取10-6、10-7、10-8的稀释菌悬液涂布到筛选培养基上，在37℃培养箱中培养24h。观察培养基平板上长出的菌落，并依菌落外观做大致分类，挑取不同形态的菌落在筛选培养基上进行平板划线分离，直至得到单菌落为止。菌株复筛：挑取单菌落于种子培养基中在37℃摇床上培养12h后行v-p实验，将阳性菌株接种到初始发酵培养基中，培养24h后用分光光度法于520nm处测定乙偶姻产量，其中编号lxf04菌株产量最高。2、根据权利要求1所述的一种高产乙偶姻菌株的选育方法，所选菌株的鉴定方法如下。（1）形态鉴定菌落的形状、干湿、颜色、边缘、表面、透明度。用光学显微镜及电子显微镜观察细胞形状、大小、是否有芽孢、鞭毛等；（2）生理生化鉴定革兰氏染色实验，淀粉水解试验，需氧性试验，明胶液化试验，过氧化氢酶试验。通过形态和生理生化鉴定确定该菌株为解淀粉芽胞杆菌，并命名为bacillusamyloliquefacienslxf04。3、本发明公开一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用bacillusamyloliquefacienslxf04为出发菌株，采用种子培养和液体发酵生产乙偶姻。（1）种子培养培养条件为：温度37℃，ph7.5，摇床转速175rpm，培养24h；培养基以g/l计：葡萄糖60，蛋白胨5，酵母粉10，kh2po40.5，乙酸钠2.4；（2）发酵培养发酵条件：接种量5%（v/v），温度37℃，ph7.5，摇床转速175rpm，培养60-70h；发酵培养基以g/l计：葡萄糖77.8g/l、蛋白胨5g/l、酵母粉22.8g/l、nacl0.05g/l、mgso40.05g/l、kh2po40.1g/l和乙酸钠2.4g/l。4、乙偶姻产量的测定（1）标准曲线的绘制将乙偶姻纯品稀释后振荡摇匀制成不同浓度梯度的乙偶姻溶液。对各梯度的乙偶姻溶液分别加入肌酸溶液和α-萘酚溶液，放置于37℃恒温培养箱中培养60min进行显色反应。显色反应后，在520nm处对各试管溶液测定吸光值，记录数据。将记录的吸光值数据与乙偶姻浓度数据进行线性拟合，生成标准曲线（附图），拟合方程：y=151x+0.006，r2=0.9994；（2）取菌液于离心管中，在10000r/min转速下离心10min，获得上清液和菌体沉淀，将上清液稀释后的菌液2ml于试管中，加入2滴肌酸和5滴α-萘酚溶液放置于37℃恒温培养箱中进行显色反应。60min后取出试管，以肌酸溶液、α-萘酚溶液和蒸馏水作为空白，用分光光度计在520nm波长下测定吸光值，带入方程，据此得到的乙偶姻的产量为42g/l。附图说明图1是乙偶姻标准曲线。具体实施方式以下为解淀粉芽胞杆菌bacillusamyloliquefacienslxf04的选育、鉴定和发酵生产乙偶姻的实施例。实施例1在果树下用小铲挖取表面约3cm厚的土壤，取土样大约50g，装入自封袋保存；取10g土壤溶解于90ml无菌水中制成悬液，以此菌悬液作为母液梯度稀释至10-8，取10-6、10-7、10-8的稀释菌悬液接种于lb液体培养基，在37℃、150r/min的摇床上培养12-24h；将富集得到的菌液梯度稀释至10-8，取10-6、10-7、10-8的稀释菌悬液涂布到筛选培养基上，在37℃培养箱中培养24h。观察培养基平板上长出的菌落，并依菌落外观做大致分类，挑取不同形态的菌落在筛选培养基上进行平板划线分离，直至得到单菌落为止；挑取单菌落于种子培养基中在37℃摇床上培养12h后行v-p实验，将阳性菌株接种到初始发酵培养基中，培养24h后用分光光度法于520nm处测定乙偶姻产量，共筛选出产乙偶姻菌株9株，其中编号lxf04菌株产量最高。实施例2对选育的lxf04菌株进行形态及生理生化鉴定（见表1）表1菌株（lxf04）的鉴定结果生理生化鉴定实验现象和结论菌落形态观察试验白色，扁平，干燥，无光泽，表面褶皱;在液体培养基中生长时，形成皱醭细胞形态观察试验均为圆形或椭圆形，单个或成对革兰氏染色均为紫红色，阳性需氧性试验均为表面生长，需氧淀粉水解试验反应为阳性明胶液化试验反应为阳性接触酶试验反应为阳性实施例31、培养基的制备(1)筛选培养基（g/l)：葡萄糖20，酵母粉2，nacl0.5，mgso40.5，kh2po40.5，琼脂粉20，ph值7.0(2)种子培养基（g/l)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，（nh4)2so46，kh2po410，nacl0.5，mgso40.5，ph值7.0(3)发酵培养基（g/l)：葡萄糖60，蛋白胨5，酵母粉10，kh2po40.5，ph值7.22、种子制备250ml三角瓶装50ml种子培养基，121℃灭菌15min，取250μl浓度为10%的保藏菌液接种于种子培养基中，37℃，摇床转速175rpm，培养24h；3、发酵培养发酵培养基分装于250ml锥形瓶中，每瓶培养基为30ml，调节ph至7.2，封装灭菌，冷却，接种5%的种子培养液，封口，温度37℃，摇床转速175rpm，培养60-70h；取发酵液离心，利用风光光度法测上清液中乙偶姻含量，产量为42g/l。当前第1页12