本发明属于生物传感技术领域，涉及一种荧光法定量检测端粒酶的技术，具体涉及基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。
背景技术：
传统的检测方法主要是利用聚合酶链式反应(pcr)法对端粒的重复序列进行扩增。此方法稳定性好，特异性高，但是需要样品量较大，灵敏性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测。此外，trap法需要使用昂贵的设备和试剂，再加上端粒酶抑制剂的开发已被提议作为人类癌症治疗的潜在方法，而trap在筛选有效的端粒酶抑制剂时易受pcr派生产物的影响，因此，该方法存在很多局限性。荧光不仅价格便宜，不需要复杂的仪器设备，而且测量简便、快速，因而得到了较快的发展。
虽然后续有一些研究者提供了很多方法来检测端粒酶，但是大多数需要借助纳米材料制备、比较贵重的仪器或比较复杂的荧光循环步骤，考虑到生物体本身复杂的环境，涉及的物质和操作过程越多，实验的重现性和准确性越差。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。本发明针对toto-1与tsprimer扩增后的链结合荧光强度会发生明显变化，从而建立荧光法检测端粒酶，同时结合exoⅲ来降低该实验方案的背景干扰，通过荧光强度的改变可以对端粒酶进行定量检测。本发明是利用toto-1对tsprimer扩增出的富g序列的特定的荧光信号增强作用来检测端粒酶的活性，同时引入exoⅲ来降低实验方案的背景信号，从而提高了该方法的灵敏性。
技术方案：本发明提供了一种基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取获得裂解后的细胞溶液；
2)将裂解后的细胞溶液加入含有端粒酶扩增引物(tsprimer)的端粒酶缓冲溶液，对tsprimer进行扩增，得到重复的富g序列的产物溶液；
3)在产物溶液中加入tsprimer的互补序列和杂交缓冲液进行杂交得到杂交好的产物；
4)在杂交好的产物中再加exoⅲ酶切除双链，最后加toto-1，孵育，检测荧光光谱。
其中，所述步骤1)的细胞的培养以及提取端粒酶的提取具体步骤如下：a549肺癌细胞加入含10％fbs和双抗的dmem培养基，在含5％co2，37℃细胞培养箱培养后收集，4×106个细胞分散在1.5ml的ep管中，用1×pbs在1800rpm离心机清洗5min后，弃去上清液，将这些收集到的细胞分散在裂解液中，冰上孵育30min后，12000rpm，4℃下离心20min，将上清液转移到无rnase离心管，快冻后保存在-80℃冰箱中。
其中，所述步骤1)细胞数目为2～4000个。
其中，所述步骤2)具体步骤如下：用端粒酶缓冲溶液将细胞配置成不同的浓度，在含有dntps、端粒酶扩增引物的端粒酶缓冲溶液中滴加不同浓度的裂解后的细胞溶液对其引物进行扩增延伸，37℃反应1～2h。
其中，所述步骤2)端粒酶缓冲溶液为含有mgcl2、egta、tween20的ph8.3的20mmtris-hcl，所述mgcl2初始浓度为1～5mm，egta初始浓度为0.05～5mm，tween20初始浓度为0.005％～1％(v/v)，dntps初始浓度为0.5～2mm。
其中，所述步骤2)的tsprimer的序列如seqidno：1所示，所述tsprimer的浓度为1～6μm。
其中，所述步骤2)细胞裂解液的细胞浓度为2～4000个cells/ml。
其中，所述步骤3)具体如下：将tsprimer的互补序列加入到已扩增好的引物中，再加入杂交缓冲液，置于95℃水浴5min后渐渐冷却至室温。
其中，所述步骤3)的杂交缓冲溶液为含有nacl、edta的tris-hcl，所述nacl初始浓度为50mm，edta的初始浓度0.1～1mm。
其中，所述步骤3)的tsprimer的互补序列终浓度为0.5～1μm。
其中，所述步骤4)具体如下：取杂交好的产物，加exoⅲ酶，37℃反应1～2小时，取toto-1加入到上述反应物中，定容至200μl，对其溶液进行记录和荧光光谱检测；
其中，步骤4)中的exoⅲ酶的终浓度为0.5～3u/μl，所述步骤4)的核酸染料toto-1浓度为25～300nm。
有益效果：本发明是利用核酸染料toto-1对tsprimer扩增出的富g序列的特定的荧光信号增强作用来检测端粒酶的活性，同时引入exoⅲ来降低实验方案的背景信号，从而提高了该方法的灵敏性。本发明原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任何大型仪器。将该方法用于肿瘤患者实际样品时，与临床诊断结果一致。所以可以将该方法进一步开发，做成一种小型诊断仪器，方便患者使用，定时诊断，将肿瘤细胞扼杀在早期。
附图说明
图1基于toto-1荧光检测端粒酶活性的流程图；
图2端粒酶检测原理验证图；图2a，a：polyadna与toto-1的荧光光谱；b：polyc与toto-1的荧光光谱；c：polyt与toto-1的荧光光谱；d：polyg与toto-1的荧光光谱；e：dsdna与toto-1的荧光光谱；图2b，a：toto-1；b：ds经过exoⅲ酶切后产物与toto-1孵育的荧光强度；c：ds经过exoⅲ酶切后产物，dntps与toto-1孵育的荧光强度；d：ds经过exoⅲ酶切后产物，a549细胞与toto-1孵育的荧光强度；e：ds经过exoⅲ酶切后产物，dntps，热处理a549细胞与toto-1孵育的荧光强度；f：ds经过exoⅲ酶切后产物，dntps，a549细胞与toto-1孵育的荧光强度；图2c，a：toto-1的荧光强度；b：toto-1与a549细胞的荧光强度；c：toto-1与dntps的荧光强度；d：ds经过exoⅲ酶切后产物与toto-1孵育的荧光强度；e：toto-1与tsprimer的荧光强度；f：toto-1与tsprimer互补dna的荧光强度；图2d，a:tsprimer与其互补序列杂交后加exoⅲ酶切后产物加toto-1的荧光光谱；b：tsprimer经端粒酶扩增后产物与tsprimer互补序列杂交后加exoⅲ酶切后产物加toto-1的荧光光谱；c：tsprimer加toto-1的荧光光谱；d：tsprimer经端粒酶扩增后产物加toto-1的荧光光谱。
图3检测端粒酶活性的条件优化图：a：tsprimer的浓度优化；b：toto-1的浓度优化；c：exoⅲ酶浓度优化；d：exoⅲ酶切时间优化。
图4检测端粒酶活性的荧光强度值变化图：图4a：在不同的a549细胞浓度下，得到的紫外-可见光曲线图(a549细胞浓度：(a)0(b)2(c)7(d)13(e)40(f)320(g)750(h)2000cells/ml)(i)4000cells/ml；图4b：荧光强度与a549细胞浓度的标准曲线；插图：荧光强度与a549细胞浓度之间的线性关系；从图中可以看出a549细胞在2cells/ml到4000cells/ml呈良好的线性关系。
图5端粒酶选择性验证；
图6bibr和姜黄素两种抑制剂对端粒酶的抑制作用，图6a:不同浓度bibr对端粒酶的抑制作用(bibr浓度：10,100,200,350,600,650nm)；图6b：不同浓度姜黄素对端粒酶的抑制作用(2,6,8,10,18,26,34μm)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
本实验中用到的试剂和仪器
实验用到的dna序列均购自上海生物工程技术服务有限公司，a549肺癌细胞购买于上海复祥生物科技公司，核酸染料toto-1购自于thermofisherscientific(美国)，bibi购于selleck化学公司(美国，休斯敦)，姜黄素购于j&k化学公司(中国，上海)。fluoromax-4荧光光谱仪(horiba，日本)。
端粒酶引物(tsprimer)序列：5′-aatccgtcgagcagagtt-3′
tsprimer的互补dna序列：5′-aactctgctcgacggatt-3′
poya5′-aaaaaaaa-3′，poyg5′-gggggggg-3′，poyt5′-tttttttt-3′
poyc5′-cccccccc-3′
实施例1原理验证1
1)我们首先检测1×pbs溶液中250nmtoto-1的荧光强度，检测结果表明核酸染料toto-1自身的荧光信号很弱，见图2b曲线a。
2)将tsprimer与其互补dna在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl，1mmedta)里面杂交后，得到dsdna。
3)将polya，polyc，polyt，polygdna，dsdna分别与toto-1混合反应1h，记录荧光光谱值，其中polya，polyc，polyt，polygdna，dsdna的终浓度均为0.27μmbp(bp代表碱基对)，toto-1的终浓度为250nm。如图2a，250nmtoto-1与polyc，polyt荧光信号几乎不可见，与polya有比较低的荧光强度，toto-1与polygdna反应有荧光增强作用，250nmtoto-1与tsprimer的荧光强度；toto-1与tsprimer互补dna的荧光强度。图2a中a：polyadna与toto-1的荧光光谱；b：polyc与toto-1的荧光光谱；c：polyt与toto-1的荧光光谱；d：polyg与toto-1的荧光光谱；e：dsdna与toto-1的荧光光谱；从图2a中可以看出，toto-1对含g碱基的dna有明显的荧光增强作用。
实施例2原理验证2
1、首先，提取细胞培养和端粒酶：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2、接着，我们做几组对照实验：第一组：在含有2mmdntps,5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液(60mmtris-hcl,ph8.3,1.5mmmgcl2,0.05mmegta，0.5％(v/v)tween20)对其tsprimer进行扩增延伸，37℃反应1h。
第二组：在含有5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液(60mmtris-hcl,ph8.3,1.5mmmgcl2,0.05mmegta，0.5％(v/v)tween20)加入750cells/ml的a549细胞裂解液，对其tsprimer进行扩增延伸，37℃反应1h。
第三组：在含有2mmdntps，5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液(60mmtris-hcl,ph8.3,1.5mmmgcl2,0.05mmegta，0.5％(v/v)tween20)加入热失活的750cells/ml的a549细胞裂解液，对其tsprimer进行扩增延伸，37℃反应1h。
第四组：在含有2mmdntps,5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液(60mmtris-hcl,ph8.3,1.5mmmgcl2,0.05mmegta，0.5％(v/v)tween20)加入750cells/ml的a549细胞裂解液，对其tsprimer进行扩增延伸，37℃反应1h。
3、酶切实验步骤：将上述第一组、第二组、第三组、第四组扩增后产物分别与tsprimer的互补dna在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，分别用1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，得到的产物用于下一步试验。同时将实施例1中得到的dsdna也采用1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，得到的产物用于下一步试验(对照2)。
4、荧光检测1：取5μl10μmtoto-1分别加入到步骤3得到的酶切产物中，孵育1h，对其溶液荧光检测，toto-1在溶液中的浓度为250nm。同时设置对照，对照为仅含有250nmtoto-1的1×pbs溶液；实验结果参见图2b显示，a：toto-1(对照1)；b：dsdna经过exoⅲ酶切后产物与toto-1孵育的荧光强度(对照2)；c：dsdna经过exoⅲ酶切后产物，dntps与toto-1孵育的荧光强度(第一组)；d：dsdna经过exoⅲ酶切后产物，a549细胞与toto-1孵育的荧光强度(第二组)；e：ds经过exoⅲ酶切后产物，dntps，热处理a549细胞与toto-1孵育的荧光强度(第三组)；f：ds经过exoⅲ酶切后产物，dntps，a549细胞与toto-1孵育的荧光强度(第四组)；通过试验得出，必须同时满足第四组试验方案中的所有条件，才能实现该方案，同时进一步说明了该方案可以准确用于端粒酶的检测。
5、荧光检测2：分别测toto-1的荧光强度(对照1)、toto-1与a549细胞裂解液混合测荧光强度(对照2)、toto-1与dntps混合测荧光强度(对照3)、dsdna经过exoⅲ酶切后产物与toto-1孵育测荧光强度(对照4)、toto-1与tsprimer混合测荧光强度(对照5)、将终浓度取3μl初始浓度50cells/ml的a549细胞裂解液，为2mmdntps，1μmtsprimer，1μmtsprimer互补dna分别与终浓度250nmtoto-1混合静置1h，记录溶液的荧光光谱。实验结果见图2c，图2c曲线a：toto-1的荧光强度(对照1)；图2c曲线b：toto-1与a549细胞的荧光强度(对照2)；图2c曲线c：toto-1与dntps的荧光强度；图2c曲线d：dsdna经过exoⅲ酶切后产物与toto-1孵育的荧光强度；图2c曲线e：toto-1与tsprimer的荧光强度；图2c曲线f：toto-1与tsprimer互补dna的荧光强度；。只有tsprimer，tsprimer互补dna和toto-1的混合溶液有荧光。该实验排除了端粒酶扩增过程中所涉及物质对检测的干扰。
实施例3基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之exoⅲ酶的背景信号降低作用
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)在含有2mmdntps，5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液(60mmtris-hcl,ph8.3,1.5mmmgcl2,0.05mmegta，0.05％(v/v)tween20)加入750cells/ml的a549细胞裂解液，对其tsprimer进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增产物。
3)在上述步骤2扩增后产物中加入5μl10μmtoto-1，孵育1h，得到产物1，对照实验：直接将tsprimer中加入5μl10μmtoto-1，孵育1h，得到产物2，对两组产物荧光检测。实验结果参见图2d(曲线c,d)显示。c：tsprimer中加toto-1的荧光光谱(产物2)；d：tsprimer经端粒酶扩增后产物加toto-1的荧光光谱(产物1)；
4)酶切实验步骤：将上述步骤2扩增后产物(浓度1μm)与tsprimer的互补dna(浓度1μm)在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，用1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，得到产物3，同时设置对照实验：直接将tsprimer与tsprimer的互补dna在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，用1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，得到产物4。得到的两组产物中分别加toto-1，孵育1h，对其溶液荧光检测。实验结果参见图2d(曲线a,b)显示。tsprimer与其互补序列杂交后加exoⅲ酶切后产物加toto-1的荧光光谱；b：tsprimer经端粒酶扩增后产物与tsprimer互补序列杂交后加exoⅲ酶切后产物加toto-1的荧光光谱。
通过图2d可以看出，其中有酶切的信号升高值为空白的4298％(曲线a,b)，无酶切的信号升高值466％(曲线c,d)。故加入exoⅲ酶可以降低该发明的信号背景，从而提高检测端粒酶的灵敏度。
实施例4基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之tsprimer的浓度优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mmtris-hcl，ph8.3，1.5mmmgcl2，0.05mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)tween20)将裂解后750cells/ml的a549细胞，在含有2mmdntps，分别用不同浓度端粒酶扩增引物(tsprimer)(1，2,3,4,5,6μm)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/ml裂解后的a549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：分别将扩增好的产物与相同浓度的tsprimer的互补dna在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，用1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：分别取5μl10μm核酸染料toto-1加入到已经用exoⅲ酶切好的产物中，孵育1h，溶液总体积用1xpbs定容至200μl，此时toto-1浓度250nm，对其溶液荧光检测。实验结果如图3a显示，tsprimer浓度选择5μm。
实施例5基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之toto-1的浓度优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mmtris-hcl，ph8.3，1.5mmmgcl2，0.05mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)tween20)将裂解后750cells/ml的a549细胞，在含有2mmdntps，5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/ml裂解后的a549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：将扩增好的产物(浓度1μm)与tsprimer的互补dna(浓度1μm)在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，用1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：分别取0.5、1、2、3、4、5、6μl浓度为10μm的核酸染料toto-1加入到已经用exoⅲ酶切好的的产物中，检测溶液总体积用1xpbs定容至200μl，toto-1终浓度分别为25、50、100、150、200、250、300nm，孵育1h，对其溶液荧光检测。实验结果如图3b显示，toto-1浓度选择处于水平阶段的浓度，选择250nm。
实施例6基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之exoⅲ酶浓度优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mmtris-hcl，ph8.3，1.5mmmgcl2，0.05mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)tween20)将裂解后750cells/ml的a549细胞，在含有2mmdntps，5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/ml裂解后的a549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μm)与tsprimer的互补dna(浓度1μm)在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，分别用不同浓度exoⅲ酶(0,0.1,0.4,0.9，1.5，2,3u/μl)切开双链，37℃反应1h,得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：取5μl初始浓度10μm核酸染料toto-1分别加入到已经用exoⅲ酶切好的产物中，检测溶液总体积用1xpbs定容至200μl，toto-1终浓度250nm孵育1h，对其溶液荧光检测。实验结果如图3c显示，exoⅲ酶浓度选择处于水平阶段的浓度选择1.5u/μl。
实施例7基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之exoⅲ酶切时间优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mmtris-hcl，ph8.3，1.5mmmgcl2，0.05mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)tween20)将裂解后750cells/ml的a549细胞，在含有2mmdntps，5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/ml裂解后的a549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μm)与tsprimer的互补dna(浓度1μm)在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，用浓度1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，分别改变酶反应时间(0,10,30,60,120,180,240min)，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：5μl10μm核酸染料toto-1分别加入到用exoⅲ酶切采用不同酶切时间好的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xpbs定容至200μl，toto-1浓度250nm，对其溶液荧光检测。实验结果如图3d显示，exoⅲ酶切时间大于等于60min即可将双链切开。
实施例8基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之端粒酶选择性验证
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)在含有2mmdntps,1μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液(60mmtris-hcl,ph8.3,1.5mmmgcl2,0.05mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(v/v)tween20)中滴加750cells/mla549细胞、750cells/ml高温失活的a549细胞、1mg/mlbsa、1mg/mlhsa、1mg/mlhrp，分别对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μm)与tsprimer的互补dna(浓度1μm)在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，用浓度1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：5μl10μm核酸染料toto-1分别加入到已经用exoⅲ酶切好的的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xpbs定容至200μl，toto-1浓度250nm，对其溶液荧光检测。实验结果参见图5显示，只有a549细胞会有荧光信号的增强，说明了该方案可以准确用于端粒酶的检测。
实施例9基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之最优实施例
基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强测定端粒酶活性的检测方法，具体步骤是：
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mmtris-hcl，ph8.3，1.5mmmgcl2，0.05mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)tween20)将裂解后的a549细胞配置成不同的浓度(a549细胞浓度：0，2，7，13，40，320，750，2000，4000个cells/ml)，在含有2mmdntps，5μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/ml裂解后的a549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μm)与tsprimer的互补dna(浓度1μm)在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交，再用1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：取5μl10μm核酸染料toto-1加入到已经用exoⅲ酶切好的的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xpbs定容至200μl，toto-1浓度250nm，对其溶液荧光检测。实验结果如图4显示，端粒酶在2～4000cells/ml呈良好的线性关系，检测限时2cells/ml。
实施例10基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之姜黄素和bibr两种抑制剂对端粒酶的抑制作用
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：a549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的dmem培养基中，并在5％co2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5ml的ep管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μl冰冷的chaps裂解缓冲液(10mmtris-hcl，ph7.5，1mmmgcl2，1mmegta(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)chaps(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mmpmsf(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的ep管中得到裂解后的a549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)在含有2mmdntps，1μm端粒酶扩增引物(tsprimer)的50μl端粒酶扩增缓冲溶液(60mmtris-hcl,ph8.3,1.5mmmgcl2,0.05mmegta，0.5％(v/v)tween20)中滴加a549细胞和分别加入不同浓度的抑制剂(bibr浓度：10,100,200,350,600,650nm；姜黄素浓度：2,6,8,10,18,26,34μm)，对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μm)与tsprimer的互补dna(浓度1μm)在杂交缓冲液(ph7.4的10mmtris-hcl，50mmnacl,1mmedta)里面杂交后，用浓度1.5u/μlexoⅲ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：5μl10μm核酸染料toto-1加入到已经用exoⅲ酶切好的的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xpbs定容至200μl，toto-1浓度250nm，对其溶液荧光检测。实验结果参见图6显示，只有a549细胞会有荧光信号的增强，说明了该方案可以准确用于端粒酶的检测。实验结果显示，抑制剂浓度越高，荧光强度越低，说明了该方案可以准确用于端粒酶抑制剂的选择。该发明对姜黄素与bibr的半数抑制浓度(ic50)值分别为8.64μm和251nm。随着抑制剂浓度变化，荧光减弱，说明该方法可用于抗癌药物的筛选。
序列表
<110>东南大学
<120>基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>端粒酶引物序列(tsprimer)
<400>1
aatccgtcgagcagagtt18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>tsprimer的互补dna序列(artificialsequence)
<400>2
aactctgctcgacggatt18