本发明涉及一种通过添加小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，属于生物合成领域。
背景技术：
：无细胞蛋白合成系统是一种体外快速、高效合成蛋白的手段，它通过在细胞提取物中添加转录翻译所需的底物和能量从而完成目标蛋白的合成。相较于体内表达，无细胞蛋白表达系统具有明显的优点：不受细胞生理限制可进行大量的毒性蛋白表达；产物不受胞内蛋白酶的降解；反应条件可控等。近年来，各种常规胞内手段难以表达的蛋白得以在体外无细胞中顺利表达(goerkear,swartzjr.developmentofcell-freeproteinsynthesisplatformsfordisulfidebondedproteins.biotechnolbioeng,2008,99(2):351–367；kanterg,yangj,voloshina,etal.cell-freeproductionofscfvfusionproteins:anefficientapproachforpersonalizedlymphomavaccines.blood,2007,109(8):3393–3399)。蛋白质作为大多数生命过程执行功能的最终形式，近年来对它的研究受到极大关注。其中，重组蛋白药物的研发在药物市场上更是占有非常重要的地位(walshg.biopharmaceuticalbenchmarks2010.[j].naturebiotechnology,2014,32(10):992)。然而，研发蛋白药物过程中需要制备大量高质量的蛋白用于蛋白结构、功能、和药效学研究，常规体内表达系统却难以满足这一不断增长的需求。为此，发展能够体外合成目标蛋白的系统以及实现蛋白的高通量表达是当今生物技术中重要的课题。技术实现要素：本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统。本发明的技术方案概述如下：一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，按体积比为(10-20):(20-30):1:(1.5-6)的比例包括组合物1、组合物2、基因及小分子糖水溶液；所述的组合物1是按1g:0.01～0.1ml:1～3ml的比例包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；所述的组合物2是按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的比例包括氨基酸水溶液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液：优选地，小分子糖水溶液为1-2g/ml的山梨糖水溶液、1-2g/ml的半乳糖水溶液、1-2g/ml的蔗糖水溶液和0.5-1g/ml的纤维二糖水溶液中至少一种。小分子糖水溶液最好是1.334g/ml的山梨糖水溶液、1.334g/ml的半乳糖水溶液、1.334g/ml的蔗糖水溶液和0.667g/ml的纤维二糖水溶液中至少一种。基因为能表达蛋白质的基因，所述基因存在的形式为基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸片段中的至少一种。细胞为真核细胞或原核细胞。缓冲溶液1优选为：5-20mmol/l三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸钾，10-20mmol/l谷氨酸镁，0.5-2mmol/l二硫苏糖醇，5-10mmol/l2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；缓冲溶液2优选为：5-20mmol/l三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸钾，10-20mmol/l谷氨酸镁，0.5-2mmol/l二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。氨基酸水溶液为用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸加入水配成的等摩尔浓度的、摩尔浓度为5-20mmol/l的混合液。反应缓冲液包括：40-60mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/l谷氨酸钾、10-25mmol/l谷氨酸镁、10-40mmol/l3-磷酸甘油酸、5-10mmol/l环磷酸腺苷、2-4mmol/l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1-4mmol/l辅酶a、0.4-0.8mmol/l亚叶酸、1-5mg/ml转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/l亚精胺；溶剂是去离子水。能量补充液包括：1-3mmol/l三磷酸尿苷，1-3mmol/l三磷酸胞苷，1-3mmol/l三磷酸腺苷，3-9mmol/l三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。本发明以基因或质粒为模板，利用细胞提取物中转录翻译过程所需的相关酶系，通过添加氨基酸、能量物质、核糖核酸聚合酶，特别是添加小分子糖，在细胞外大量合成所需的目的蛋白。本发明的优点：本发明提高了无细胞蛋白合成系统体外生产蛋白质的产量，方法简便快速，可满足目前蛋白质结构和功能组学研究要求。附图说明图1为添加不同浓度的山梨糖后egfp表达量的变化。图2为添加不同浓度的半乳糖后egfp表达量的变化。图3为添加不同浓度的蔗糖后egfp表达量的变化。图4为添加不同浓度的纤维二糖后egfp表达量的变化。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。实施例1-3为缓冲溶液1，见表1。表1实施例1实施例2实施例3三羟甲基氨基甲烷20mmol/l10mmol/l5mmol/l谷氨酸钾100mmol/l60mmol/l30mmol/l谷氨酸镁20mmol/l15mmol/l10mmol/l二硫苏糖醇2mmol/l1mmol/l0.5mmol/l2-巯基乙醇10mmol/l8mmol/l5mmol/l溶剂是去离子水补足至1l补足至1l补足至1l实施例4-6为缓冲溶液2，见表2。表2实施例4实施例5实施例6三羟甲基氨基甲烷20mmol/l10mmol/l5mmol/l谷氨酸钾100mmol/l60mmol/l30mmol/l谷氨酸镁20mmol/l15mmol/l10mmol/l二硫苏糖醇2mmol/l1mmol/l0.5mmol/l溶剂是去离子水补足至1l补足至1l补足至1l实施例7细胞破碎产物的制备：将培养后的大肠杆菌(大肠埃希氏菌bl21(de3)cicc23796，购买于cicc)收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。细胞破碎的方法除机械法外，还可以采用反复冻融法、超声处理法、酶解法、碱裂解法或化学渗透法。破碎过程采用超声波细胞粉碎机，功率为20w，每个循环超声5s，停10s，总时间为1h(每次取10-15ml进行破碎)。实施例8-10为组合物1，见表3.表3实施例8实施例9实施例10细胞破碎产物实施例7制备1g实施例7制备1g实施例7制备1g缓冲溶液1实施例1制备0.1ml实施例2制备0.05ml实施例3制备0.01ml缓冲溶液2实施例4制备3ml实施例5制备2ml实施例6制备1ml实施例11-13为氨基酸水溶液，见表4表4实施例14-16为反应缓冲液，见表5表5实施例14实施例15实施例164-羟乙基哌嗪乙磺酸60mmol/l50mmol/l40mmol/l谷氨酸钾120mmol/l100mmol/l80mmol/l谷氨酸镁25mmol/l18mmol/l10mmol/l3-磷酸甘油酸40mmol/l25mmol/l10mmol/l环磷酸腺苷10mmol/l8mmol/l5mmol/l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸4mmol/l3mmol/l2mmol/l辅酶a4mmol/l3mmol/l1mmol/l亚叶酸0.8mmol/l0.6mmol/l0.4mmol/l转运核糖核酸5mg/ml3mmol/l1mmol/l亚精胺0.8mmol/l0.6mmol/l0.4mmol/l去离子水补足至1l补足至1l补足至1l实施例17-19为能量补充液，见表6实施例17实施例18实施例19三磷酸尿苷3mmol/l2mmol/l1mmol/l三磷酸胞苷3mmol/l2mmol/l1mmol/l三磷酸腺苷3mmol/l2mmol/l1mmol/l三磷酸鸟苷9mmol/l2mmol/l3mmol/l去离子水补足至1l补足至1l补足至1l实施例20-22为组合物2(各组份为体积比)见表7实施例20实施例21实施例22氨基酸混合液8ml实施例11制备5ml实施例12制备2ml实施例13制备反应缓冲液30ml实施例14制备25ml实施例15制备20ml实施例16制备能量补充液5ml实施例17制备3ml实施例18制备2ml实施例19制备核糖核酸聚合酶水溶液1ml150μg/ml1ml70μg/ml1ml5μg/ml实施例23一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，体积比为20:25:1:(1.5、3、4.5、6、7.5)的比例包括组合物1(实施例8制备)、组合物2(实施例20制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及1.334g/ml的山梨糖水溶液；制备过程是：将组合物1、组合物2、基因和5个体积的1.334g/ml的山梨糖水溶液混匀，分别放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量随山梨糖浓度的变化关系如图1所示。实施例24一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为20:25:1:3的比例的组合物1(实施例8制备)、组合物2(实施例20制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及1g/ml的山梨糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例23的四种物质的体积比为(20:25:1:3)时结果相似。实施例25一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为20:25:1:3的比例的组合物1(实施例8制备)、组合物2(实施例20制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及2g/ml的山梨糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例23的四种物质的体积比为(20:25:1:3)时结果相似。实施例26一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，体积比为10:30:1:(1.5、3、4.5、6、7.5)的比例包括组合物1(实施例9制备)、组合物2(实施例21制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及1.334g/ml的半乳糖水溶液；制备过程是：将组合物1、组合物2、基因和5个体积的1.334g/ml的半乳糖水溶液混匀，分别放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量随半乳糖浓度的变化关系如图2所示。实施例27一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为10:30:1:3的比例的组合物1(实施例9制备)、组合物2(实施例21制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及1g/ml的半乳糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例26的四种物质的体积比为(10:30:1:3)时结果相似。实施例28一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为10:30:1:3的比例的组合物1(实施例9制备)、组合物2(实施例21制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及2g/ml的半乳糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例26的四种物质的体积比为(10:30:1:3)时结果相似。实施例29一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，体积比为15:20:1:(1.5、3、4.5、6、7.5)的比例包括组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)、基因(prset-egfp购于：promegacorporation)及1.334g/ml的蔗糖水溶液；制备过程是：将组合物1、组合物2、基因和5个体积的1.334g/ml的蔗糖水溶液混匀，分别放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量随蔗糖浓度的变化关系如图3所示。实施例30一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为15:20:1:3的比例的组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及1g/ml的蔗糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例29的四种物质的体积比为(15:20:1:3)时结果相似。实施例31一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为15:20:1:3的比例的组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及2g/ml的蔗糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例29的四种物质的体积比为(15:20:1:3)时结果相似。实施例32一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，体积比为15:20:1:(1.5、3、4.5、6、7.5)的比例包括组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation))及0.667g/ml的纤维二糖水溶液；制备过程是：将组合物1、组合物2、基因和5个体积的0.667g/ml的纤维二糖水溶液混匀，分别放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量随纤维二糖浓度的变化关系如图4所示。实施例33一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为15:20:1:1.5的比例的组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation)及0.5g/ml的纤维二糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例32的四种物质的体积比为(15:20:1:1.5)时结果相似。实施例34一种含小分子糖的体外高效合成蛋白质的系统，将体积比为15:20:1:1.5的比例的组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)、基因(prset-egfp(购于：promegacorporation)及1g/ml的纤维二糖水溶液混匀，放在96孔板中，30℃下反应12h，进行检测，得到蛋白表达量与实施例32的四种物质的体积比为(15:20:1:1.5)时结果相似。prset-egfp(购于：promegacorporation)质粒可以购买或通过基因改造获得。山梨糖、半乳糖、纤维二糖(购于索莱宝公司)，蔗糖(购于光复公司)所述基因为能表达蛋白质的基因，实验证明，用所述基因存在的形式基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸片段中的至少一种替代实施例23中的基因，其它同实施例23，得到相应的蛋白。实验证明，用实施例7的方法对真核细胞进行破碎，用破碎后的细胞破碎产物，采用实施例25的方法可得到体外高效表达蛋白质的无细胞蛋白表达系统。当前第1页12