本发明涉及兽医生物技术领域的快速诊断技术，具体是一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)是可引发猪的一种高度接触性的肠道传染病（pensaertetal.,1978），又名猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)。主要临床表现为病猪呕吐、急性水样腹泻、脱水以及仔猪的高死亡率等。本病可感染各个年龄阶段的猪，对不同年龄阶段的病猪的危害程度各不相同，尤其3日龄以内的仔猪发病情况最为严重，死亡率为80％-100％。近年来ped的蔓延趋势不断扩大，2013年在美国迅速发病并全美范围内传播流行，该病已在世界范围内造成严重的影响。20世纪八十年代猪流行性腹泻就在中国开始出现，在以后的时间里一直存在。
剖检发病仔猪肠壁上有点状出血，肠壁变薄严重时呈透明状。可据此对腹泻症状进行初步疾病诊断，而确诊需要通过实验室检测技术。随着分子生物学技术的迅速发展，针对于pedv核酸的检测方法越来越受到人们的青睐，rt-pcr方法对诊断ped具有很好的敏感性和特异性。ishikawa等根据s基因序列设计了一对引物，扩增目的片段为854bp，建立的rt-pcr方法对细胞毒和粪便毒进行检测(ishikawaetal.,1997)。郭容利建立了同时检测pedv、tgev和parv多重rt-pcr方法，该法具有良好的特异性和敏感性(郭容利等，2013)。任玉鹏等建立了pedv、pev-9、pkv的三重rt-pcr，该方法与单项rt-pcr法相比，阳性样本的检出符合率在91%以上，表明该方法具有较高可信度，可以快速、准确的检测3种猪腹泻病毒性病原(任玉鹏等，2014)。
荧光定量聚合酶链反应技术是指将反应体系中加入荧光基团，利用荧光实时监测的方法，并最终通过标准曲线对未知模板的检测方法进行定量分析。聚合酶链反应定量技术克服了简单的污染、长时间的处理步骤、缺乏准确、定量的方法。劳秀杰根据genbank中的n基因高度保守核苷酸序列，设计合成一对引物，建立了检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。孟凡伟等通过构建含有m基因片段的重组质粒，利用该重组质粒进行sybrgreenireal-timepcr，成功的建立了检测pedv的荧光定量pcr的方法。研究结果表明建立的real-timepcr方法具有良好的特异性强、灵敏性，重复性(孟凡伟等，2014)。zhao等利用pedvs基因，设计引物，建立了多重探针荧光定量pcr的技术方法，在区分变异毒株和经典毒株，该方法能得到很好的应用(zhaoetal.,2014)。刘邓等成功建立了一种快速检测pedv病毒含量的taqman焚光定量pcr方法，借用此方法对60份临床样品进行检测，55份阳性样品，检测阳性率为92%，而对同种样品用常规rt-pcr方法检出阳性率仅为80%，表明该荧光定量pcr方法的具有良好的敏感性（刘邓等，2010）。
直扩荧光rt-pcr方法是利用一类经过基因工程改造的高耐受的taqdna聚合酶，这类酶可以直接以全血、血清、尿液、粪便、土壤、牛奶、动物组织等材料为模板，无需经过核酸提取的步骤，经一步rt-pcr扩增目的基因，从而显著简化检测流程，节省时间和成本，提高检测效率。目前国内外已经建立了多种检测pedv核酸的rt-pcr或荧光rt-pcr方法，但还未见关于pedv直扩荧光rt-pcr方法的报道。本发明以pedv的n基因为靶序列，分别设计特异性的引物和探针，通过反应条件的优化，建立了一种检测猪流行性腹泻病毒的直扩荧光rt-pcr方法，并组装成了试剂盒进行应用。
技术实现要素：
本发明根据genbank中登录猪流行性腹泻病毒（pedv）的n基因序列，应用dnastar、megalign软件的序列比对功能及primerexpress3.0软件，设计了1套特异性引物和探针，结合高效的直扩rt-pcr商品试剂，经实验条件优化，组合而成的一种成熟的直扩法荧光rt-pcr检测试剂盒。该试剂盒能对检组织样品进行直接检测，检测过程简单，交叉污染几率小。从病料处理到获得结果只需1.5小时，结果准确且灵敏度高、特异性好，是目前猪流行性腹泻病毒检测方法非常好的一种替代方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样来实现的：
一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，包括以下引物序列，其核苷酸序列为：
pedv上游引物：5’-tggcatttctactacctcgg-3’；
pedv下游引物：5’-agtgggttcagtctttgcg-3’；
pedv探针引物：
5’-hex-acgccgacctccgttataggactcgt-bhq1-3’。
上述应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，该试剂盒反应体系中包含以下成分：
2×s/pqrt-pcrmix；25×s/pqrtpcrpolymerases；10µmpedv上游引物；10µmpedv下游引物；10µmpedv探针引物；阳性对照；阴性对照。
其中将pedv分离株接种到含有5µg/ml胰酶培养液的vero细胞单层，至72h时后，细胞出现聚集、融合形成合胞体等细胞病变，细胞病变率达75%左右时，冻融收集细胞毒，8000r/m离心5min，收集上清为阳性对照；高压灭菌处理depc水为阴性对照。
一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，使用上述引物的试剂盒，包括以下步骤：取疑似感染pedv的病料，稀释、离心后取上清液为检测样品，用上述引物进行荧光rt-pcr扩增，反应结束后，根据扩增曲线和ct值判定结果，反应结果在hex通道检测。
进一步的，应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，该试剂盒反应体系为25µl时，反应体系中包含以下成分：2×s/pqrt-pcrmix12.5µl、25×s/pqrt-pcrpolymerases1µl，上、下游引物（10µm）各1µl，探针引物（10µm）0.5µl，检测样本5µl，depc水4.0µl。
荧光rt-pcr循环条件为：50℃30min，95℃5min，然后94℃10s，60℃30s，进行40个循环。
具体的应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法，包括以下步骤：
（1）检测样本制备
取疑似感染pedv的小肠内容物或粪便作为检测病料，用pbs稀释成1：3乳剂，8000r/min离心5分钟，上清为检测样本；
（2）直扩荧光rt-pcr反应体系建立和扩增
取荧光定量pcr反应管，加入2×s/pqrt-pcrmix12.5µl、25×s/pqrt-pcrpolymerases1µl，pedv上、下游引物（10µm）各1µl，pedv探针引物0.5µl（10µm），检测样本5µl，depc水4.0µl，进行荧光rt-pcr扩增；荧光rt-pcr循环条件为：50℃30min，95℃5min，然后94℃10s，60℃30s，进行40个循环；
（3）直扩荧光rt-pcr检测结果判定
反应结束后，根据扩增曲线和ct值判定结果，反应结果在hex通道检测，扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的检测样品直接判定为阳性，扩增反应在35个循环以上的需要重复试验，若仍然是35个循环以上判定为阴性。
本发明的有益效果为：
（1）操作简便，省时省力。本发明采用商品化直扩荧光rt-pcr试剂，无需要核酸提取过程，经过条件优化，在90min内，即可完成pedv的检测工作。比常用的二步法rt-pcr及荧光定量rt-pcr检测方法操作简便，省时省力。
（2）核酸交叉污染几率低。由于本发明不涉及单独提取病原核酸的过程，反转录及pcr反应均在密闭体系内进行，降低核酸气溶胶形成的几率，避免了二步法rt-pcr过程中加样所造成的pcr污染。
（3）特异性强、重复性好、灵敏度高。本试剂盒仅对pedv的核酸有扩增产物，对猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪轮状病毒（rv）、猪伪狂犬病毒（prv)、圆环病毒(pcv2)、蓝耳病毒(prrsv)、乙脑病毒(jev)、猪瘟病毒(csfv）及vero细胞培养液无扩增曲线；对pedv疫苗毒及阳性病料检测结果重复性100%，批内和批间检测的变异系数均小于5%；可检测到10个tcid50/0.1ml的pedv抗原。
附图说明：
图1所示为实施例3的pedv直扩荧光扩增曲线图（hex）；
图2所示为实施例4的pedv直扩荧光方法特异性试验结果图；
图3所示为实施例5的pedv直扩荧光方法敏感性试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但是并不以此限制本发明。
实施例1：应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒，引物序列的设计
包括以下引物序列，其核苷酸序列为：
pedv上游引物：5’-tggcatttctactacctcgg-3’；
pedv下游引物：5’-agtgggttcagtctttgcg-3’；
pedv探针引物：
5’-hex-acgccgacctccgttataggactcgt-bhq1-3’。
实施例2：应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒的制备
该试剂盒反应体系中包含以下成分：2×s/pqrt-pcrmix；25×s/pqrtpcrpolymerases；10µmpedv上游引物；10µmpedv下游引物；10µmpedv探针引物；阳性对照；阴性对照。
其中2×s/pqrt-pcrmix；25×s/pqrtpcrpolymerases均为商品化市购产品，可采用美国vitanavi公司的产品（货号为vnd784rtk）。
本发明试剂盒组成(20t/盒)及保存条件：
2×s/pqrt-pcrmix250μl×1管-20℃保存
25×s/pqrtpcrpolymerases20μl×1管-20℃保存
10µmpedv上游引物20μl×1管-20℃保存
10µmpedv下游引物20μl×1管-20℃保存
10µmpedv探针引物10μl×1管-20℃保存
阳性对照200μl×1管-20℃保存
阴性对照200μl×1管-20℃保存
本发明试剂盒有效期12个月。
实施例3：应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法
（1）检测样本制备
取疑似感染pedv的小肠内容物或粪便作为检测病料，用磷酸盐缓冲液（pbs）(0.01m，ph=7.4)稀释成1：3乳剂，8000r/min离心5分钟，上清为检测样本；
（2）直扩荧光rt-pcr反应体系建立和扩增
采用实施例2直扩荧光rt-pcr试剂盒，取rt-pcr反应管，加入2×s/pqrt-pcrmix12.5µl、25×s/pqrt-pcrpolymerases1µl，中的pedv上、下游引物（10µm）各1µl，pedv探针引物0.5µl（10µm），检测样本5µl，depc水4.0µl，在扩增仪上进行荧光rt-pcr扩增；荧光rt-pcr循环条件为：50℃30min，95℃5min，然后94℃10s，60℃30s，进行40个循环；
（3）直扩荧光rt-pcr检测结果判定
反应结束后，根据扩增曲线和ct值判定结果，反应结果在hex通道检测，扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的检测样品直接判定为阳性，扩增反应在35个循环以上的需要重复试验，若仍然是35个循环以上判定为阴性。
同时对阳性对照和阴性对照检测，采用同样荧光rt-pcr循环条件，阳性对照扩增曲线明显，阴性对照没有扩增（如说明书附图1）。
实施例4：方法的特异性试验
采用直扩荧光rt-pcr方法，按照实施例3优化后的反应体系和最佳反应条件，分别以pedv、tgev、rv、prv、pcv2、prrsv、jev、csfv、vero细胞为模板，对该方法的特异性进行评估。试验结果显示，在hex通道，只有pedv样品呈阳性扩增反应，其他病毒对照和vero细胞对照均呈阴性反应，无扩增曲线形成；表明所建立的方法特异性好，且与其他病毒样品无交叉反应（如说明书附图2）。
实施例5，方法的敏感性试验
将含有106个tcid50/0.1ml的pedv抗原作10倍系列稀释，采用已优化的直扩荧光rt-pcr进行扩增，对该方法的敏感性进行评估。结果显示，建立的直扩荧光rt-pcr方法可检测到稀释度为1x10-5pedv抗原，此时可检测到10个tcid50/0.1ml的pedv抗原，说明所建立的方法具有良好的检测灵敏度（如说明书附图3）。
实施例6，方法的可重复性试验
表1.可重复性试验分析结果
分别采用等量的4份不同浓度梯度的模板进行直扩荧光rt-pcr试验，每份模板每个浓度做3个重复，以确定该方法的批内差异。在不同的时间段对4份不同浓度梯度的模板进行3次直扩荧光rt-pcr试验，以确定该方法的批间差异。批内变异试验结果显示，变异系数在0.21%~2.39%，批间变异试验结果显示，变异系数在1.11%~2.46%，均小于5%，表明该方法重复性好（如表1所示）。
实施例7，临床样品的检测
采用本发明所建立的方法，对保存的30份阳性临床样品进行检测，并设pedv阳性对照。结果显示，直扩荧光rt-pcr方法检测阳性临床样品，均能出现典型的扩增曲线，表明该方法可应用于临床检测应用。
序列表
<110>深圳市康百得生物科技有限公司
<120>一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的专用试剂盒和诊断方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tggcatttctactacctcgg20
<210>2
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