本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22的分子标记。
背景技术：
冷害是造成水稻产量损失、限制水稻种植分布的最重要非生物胁迫因素之一。当前，冷害频繁发生，在中国每年因冷害造成的损失高达300–500万吨。分子遗传学研究表明，水稻对低温的抗性是受多基因控制的数量性状。与种子发芽期、苗期等时期相比，水稻在孕穗期(生殖期)耐冷性非常重要。迄今，已有108个孕穗期(生殖期)耐冷qtl被鉴定出来，可解释的表型变异率从0.8％to37.8％。在这108个qtl中,只有qct8、qctb7、qctb3、qct-3-2、qltb3和qctb10-2等少数被精细定位，仅ctb1和ctb4a两个基因被克隆。上述促使水稻在孕穗期具有耐冷性的等位基因主要来源于自然变异，这些基因的定位和克隆有助于我们了解水稻对低温抗性遗传基础，但目前可供利用的孕穗期耐冷优良基因非常匮乏。因此，挖掘优异的耐冷等位基因具有重要意义。
过去几十年来，基于双亲本衍生群体的连锁作图是定位基因的常用策略。但双亲本衍生群体定位到的qtl，只能比较每个基因位点2个亲本间的等位基因效应，无法鉴定出种质资源中存在的更优的有利等位基因，更为重要的是定位群体与育种群体的相互脱节，导致定位群体中定位到的qtl由于存在遗传背景效应，在实际育种群体中很难应用。近年来，利用多个亲本构建遗传上相互关联的高代互交系(multi-parentsadvancedgenerationinter-cross,magic)群体及不同品种导入同一优良品种背景构建的重组自交系(nestedassociationmapping，nam)或回交导入系(backcrossintrogressionline,bil)群体，在qtl定位和有利基因定位方面有越来越多的应用实例。多亲本群体克服了双亲本群体无法挖掘有利等位基因的缺陷，而且可以比较qtl在不同遗传背景的表达情况，同时能较好地解决qtl定位与育种群体脱节的问题。
利用大规模回交策略开展分子遗传与分子育种相结合研究是本课题组的优势之一。通过该策略，我们将不同来源的种质资源导入到优良品种背景，结合对非生物逆境如旱、盐、冷等胁迫，培育抗逆极端选择导入系群体，用于抗逆目标性状的qtl定位。在此基础上，根据目标选择性状表型及带有的qtl有利等位基因信息，开展分子标记辅助设计聚合育种，实现了不同抗旱基因、耐盐基因、耐低氮基因及抗旱与耐低氮基因的聚合，创制出一批耐不同非生物境逆的水稻种质材料。同时，开发了利用相同背景同一目标性状的多个极端选择导入系群体联合偏分离检测目标性状qtl的方法，大大减少了假阳性，提高了qtl的检测效率和可靠性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题为：提供一种水稻孕穗期耐冷基因的分子标记。
本发明的技术方案为：水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22的分子标记，为采用引物对rm160以带有籼稻品种x22血缘的育种材料基因组dna为模版扩增出来的85bp核苷酸序列；引物对rm160的正向引物序列为：agctagcagctatagcttagctggagatcg(seqidno.1所示)，引物对rm160的反向引物序列为：tctcatcgccatgcgaggcctc(seqidno.2所示)。
水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22的分子标记的特异性引物对，该特异性引物对正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示。
水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22的分子标记的特异性引物对在筛选水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22上的应用。
利用水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22的分子标记鉴定、选育水稻的方法，采用引物对rm160以带有籼稻品种x22血缘的育种材料基因组dna为模版进行pcr扩增，并检测扩增产物，如果能扩增出来85bp核苷酸片段，则标志检测的育种材料存在水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22；引物对rm160的正向引物序列如seqidno.1所示，引物对rm160的反向引物序列如seqidno.2所示。
本发明利用北方粳稻品种超优1号为轮回亲本，与5个供体品种配制的回交导入系随机群体，经孕穗期耐冷筛选和后代验证，获得耐冷导入系群体，结合分子标记在水稻第9染色体上定位到孕穗期表达的耐冷基因qct9.6x22，鉴定出与该耐冷基因紧密连锁的pcr的实用经济型标记rm160，利用其可有效地开展水稻孕穗期耐冷的分子辅助选择育种研究。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明鉴定到第9染色体上的孕穗期耐冷新基因(qct9.6x22)以及可对其进行基因型鉴别的共显性分子标记。与目前报道的影响孕穗期耐冷基因qct8、qctb7、qctb3、qct-3-2、qltb3、qctb10-2、ctb1和ctb4a等基因不同，qct9.6x22是来源于越南的籼稻品种x22的一个控制水稻孕穗期耐冷性的新基因位点，为分子标记辅助选择提高水稻孕穗期耐冷性提供了抗逆性基因。
2、通过新基因标记的筛选，能够获得孕穗期耐冷性提高的抗逆育种材料。
3、本发明的分子标记可用于孕穗期育种群体的基因型选择，有效地鉴别带有该基因的耐冷个体，便于及时的杂交转育，加快育种进程。
附图说明
图1用于孕穗期耐冷qtl定位和验证的群体构建；
图2超优1号/x22的回交后代耐冷导入系ct5(仅带有qct9.6x221个耐冷基因)与冷敏感导入系ct12(不带有任何耐冷基因)杂交的f2群体经ssr标记rm160的pcr扩增产物在5％聚丙烯酰胺凝胶电泳的带型图谱与对应单株的耐冷性表现(1-37为随机选取的f2代单株；m为dnaladder；ct12为冷敏感导入系；ct5为耐冷导入系；a为130bp，b为85bp)。
具体实施方式
实施例1
(一)耐冷qtl定位
1.供试材料和定位群体的构建
首先以筛选3个籼稻品种x22、doddi、丰矮占和2个粳稻品种chhomrong、原粳7号分别与我国北方高产优质不耐冷的粳稻超优1号杂交、回交和单粒传自交，构建5个bc2f4随机导入系群体。2008年在吉林省农科院水稻所，每群体种植450个bc2f4单株，于幼穗分化期用20cm深的19℃地下井水灌溉30天，直至所有穗抽完全抽出后恢复正常水温灌溉，成熟后对照超优1号的结实率为24.8％，选结实率高于50％的单株收获，获得162株孕穗期耐冷单株(图1)。2009年将162个耐冷单株种成株系，在同样冷胁迫处理条件下鉴定耐冷性，对照超优1号结实率为35.1％，入选结实率在40％以上耐冷单株132株。2010年将132个耐冷单株种成株系，在同样冷胁迫处理条件下重复鉴定耐冷性，最终筛选出5个家系共计84个孕穗期耐冷株系构成选择育种群体(表1)。
表15个选择育种群体构成信息及耐冷性(冷胁迫下的结实率)表现
2.基因型鉴定
参考temnykh等(2000年)的dna提取方法，对各单株分别提取基因组dna。以供体亲本和轮回亲本超优1号间有多态的ssr引物分别对不同耐冷株系及随机群体株系的基因型进行鉴定，5个群体的平均多态ssr引物为113个。反应产物在5％非变性聚丙烯酰胺上电泳，用genefinder染料染色读带。每个群体的标记位置和遗传距离参照cornellssrmaps(grammene,http://www.gramene.org)，标记覆盖基因组大小从超优1号/原粳7号的1,125.0cm到超优1号/chhomrong的1649.8cm不等，相邻标记间的平均遗传距离从15.2cm到23.7cm不等。
3.偏分离分析定位qtl
由于84个株系由不同5个不同家系组成，不同家系间多态性标记存在差异，因此我们首先按照cui等(2015)的方法发展了一个标记一致的遗传连锁图谱。进而采用cui等(2015)提供的偏分离定位方法开展耐冷qtl的定位。以wald值为22.2(p≤0.05)作为判断qtl存在与否的标准。
5个家系共计定位到17个孕穗期耐冷qtl，包括超优1号/x22群体检测到的3个，超优1号/原粳7号检测到的2个，超优1号/丰矮占检测到的11个，超优1号/chhomrong检测到的2个和超优1号/doddi检测到的4个(表2)。其中，qct1.3、qct6.7和qct9.6在2个群体中被检测到，qct6.5在3个群体中被检测到(表2)。qct9.6是新定位到的表型效应较大的1个主效耐冷qtl，与rm160紧密连锁，该位点来自x22的等位基因提高孕穗期耐冷性。
表2采用单个和联合偏分离方法定位到影响孕穗期耐冷的主效qtl
1当p≤0.05和0.01时，wald值分别为22.2和28.0。a：x22，b：原粳7号，c：丰矮占，d：chhomrong，e：doddi。
(二)qct9.6x22的验证
1.供试材料
利用原始未经过胁迫处理的超优1号/x22高代回交bc2f4随机群体的60个株系，用于验证来自x22的qct9.6耐冷基因。
2.基因型鉴定
使用常规的ctab法提取超优1号/x22随机株系的基因组dna。采用与qct9.6紧密连锁的rm160引物(正向引物序列为agctagcagctatagcttagctggagatcg，反向引物序列为：tctcatcgccatgcgaggcctc)鉴定株系的基因型。采用20μl体系的常规pcr操作流程扩增不同株系的模板dna，以5％的聚丙烯凝胶电泳进行pcr产物的分离。
3.孕穗期耐冷表型评估
2010年在吉林省农科院水稻所，群体种植60个bc2f4株系，于幼穗分化期用20cm深的19℃地下井水灌溉30天，直至所有穗抽完全抽出后恢复正常水温灌溉，统计成熟后的结实率，以株系结实率作为评价指标。
3.单标记分析
根据不同株系的rm160标记扩增条带所表示的基因型，将每个家系的60个株系分成两组，一组是13个株系带有超优1号纯合基因型，平均结实率为3.2％，另一组是16个株系带有供体x22纯合基因型，平均结实率为11.2％，冷旱胁迫下两组的平均株系结实率差异达到8.0％，差异达显著水平，且抗性有利等位基因来自供体亲本。这表明qct9.6是一个真实存在的孕穗期耐冷qtl，同时也表明rm160确实与qct9.6紧密连锁。
表3利用超优1号/x22bc2f4随机群体验证孕穗期耐冷qtl(qct9.6)
(三)利用与qc9.6紧密连锁的分子标记rm160辅助选择耐冷的效果验证
1.供试材料
利用超优1号背景的耐冷导入系ct5，其仅携带qct9.6x221个耐冷qtl，与超优1号背景的冷敏感导入系ct12(不带任何耐冷qtl，qct9.6等位基因与超优1号相同)杂交，构建240株f2分离群体为供试材料。
2.dna提取、pcr扩增及凝胶电泳
参照(一)中株系基因组dna的提取方法和pcr扩增方法，提取240株的基因组dna并利用qct9.6基因的紧密连锁标记rm160进行pcr扩增，反应产物在5％非变性聚丙烯酰胺上电泳，用genefinder染料染色读带。
3.孕穗期耐冷表型评估
2011年在吉林省农科院水稻所，种植240个f2群体，于幼穗分化期用20cm深的19℃地下井水灌溉30天，直至所有穗抽完全抽出后恢复正常水温灌溉，统计成熟后的结实率，以株系结实率作为评价指标。
4.单标记分析
根据不同单株的rm160标记扩增条带所表示的基因型，群体中携有x22带型的纯合基因型个体54株，平均结实率为16.6％，变幅为10.7％－19.2％；携有超优1号带型的纯合基因型个体58株，平均结实率为5.8％，变幅为3.3％－9.6％；杂合基因型个体128株，平均结实率为14.8％，变幅为12.4％－18.9％。表明依据rm160引物扩增出与x22大小相同的纯合或杂合片段，可以推测该单株带有qct9.6x22耐冷等位基因，表现为孕穗期耐冷，反之，则不耐冷(图2)。表4为与图2对应的单株的基因型及耐冷性(结实率)，表明通过m160标记基因型鉴定可以很好的鉴别qct9.6基因型，预测qct9.6基因的表现型。因此，与qct9.6紧密连锁的标记rm160可以直接应用于水稻孕穗期耐冷分子辅助选择育种。
表4超优1号/x22的回交后代耐冷导入系ct5(仅带有qct9.6x221个耐冷基因)与冷敏感导入系ct12(不带有任何耐冷基因)杂交的f2群体经标记rm160辅助鉴定不同基因型个体的耐冷性(结实率)表现
序列表
<110>申请人名称
<120>水稻孕穗期耐冷基因qct9.6x22的分子标记及应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agctagcagctatagcttagctggagatcg30
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tctcatcgccatgcgaggcctc22