本发明涉及一种用于检测小麦中有无黄叶基因的专用引物、试剂盒及其应用，属于分子遗传学技术领域。
背景技术：
叶片是植物进行光合作用的主要器官。叶片通过光合作用将光能转换成化学能调控植物生长和发育。叶色突变常直接或间接影响叶绿素的生物合成或降解，从而影响叶绿素的含量，所以也被称为叶绿素缺失突变。叶色变异通常会降低突变体的光合作用，造成作物减产，严重时甚至导致植物死亡，所以很长时间被认为是无意义的突变。然而，近年来叶色突变体受到遗传学家和分子生物学家的广泛关注。由于叶色变异常影响植物光合系统的功能与稳定，因而叶色突变是研究植物光合作用、叶绿素生物合成与分解代谢、激素生理、叶绿体结构与功能及基因表达调控等方面的理想材料。植物叶色突变最早发现于20世纪30年代。迄今为止，国内外在水稻(zhux,guos,wangz,etal.map-basedcloningandfunctionalanalysisofygl8,whichcontrolsleafcolourinrice(oryzasativa).bmcplantbiology,2016,16:134)、玉米(liuxp,gaobz,hanfq,etal.geneticsandfinemappingofapurpleleafgene,bopr,inornamentalkale(brassicaoleraceal.var.acephala).bmcgenomics,2017,18:230)、大麦(qind,dongj,xuf,etal.characterizationandfinemappingofanovelbarleystagegreen-revertiblealbinogene(hvsgra)bybulkedsegregantanalysisbasedonssrassayandspecificlengthamplifiedfragmentsequencing.bmcgenomics,2015,16:838)和四倍体小麦(lin,jiaj,xiac,etal.characterizationandmappingofnovelchlorophylldeficientmutantgenesindurumwheat.breedingscience,2013,63:169-175)等植物均发现存在叶色突变。
目前，利用水稻叶色突变体已成功定位了100多个水稻叶色相关基因，其大多数受一对隐性核基因控制。这些基因分布于水稻的12对染色体上，其中第3染色体分布较多，有40多个水稻叶色突变相关基因被克隆(dup,lingyh,sangxc,etal.genemappingrelatedtoyellowgreenleafinamutantlineinrice(oryzasatival.).genes&genomics,2009,31:165-171；zhux,guos,wangz,etal.map-basedcloningandfunctionalanalysisofygl8,whichcontrolsleafcolourinrice(oryzasativa).bmcplantbiology,2016,16:134)。例如，wu等从水稻黄绿叶突变体中图位克隆了叶绿素合成酶基因osygl1(wuzm,zhangx,heb,etal.achlorophyll-deficientricemutantwithimpairedchlorophyllideesterificationinchlorophyllbiosynthesis.plantphysiology,2007,145:29-40)。小麦上，watanabe和koval将来源于普通小麦和四倍体小麦的3个叶色突变基因(cn-a1，cn-b1和cn-d1)分别定位于7a、7b和7d染色体的长臂上(watanaben,kovalsf.mappingofchlorinamutantgenesonthelongarmofhomoeologousgroup7chromosomesincommonwheatwithpartialdeletionlines.euphytica,2003,129:259-265)。li等将来自四倍体小麦的2个黄绿叶基因ygld1和ygld2分别定位于5al和5bl染色体臂，ssr标记xwmc110和xwmc28分别和这两个基因表现共分离(lin,jiaj,xiac,etal.characterizationandmappingofnovelchlorophylldeficientmutantgenesindurumwheat.breedingscience,2013,63:169-175)。ansari等将来自二倍体小麦的黄叶基因clm1定位于7aml染色体臂上，ssr标记xgwm473和xwmc96与该基因的遗传距离分别为2.1cm和2.6cm(ansarimj,al-ghamdia,kumarr,etal.characterizationandgenemappingofachlorophyll-deficientmutantclm1oftriticummonococcuml.biologiaplantarum,2013,57:442-448)。但是，对于控制普通小麦黄叶基因的研究未见报道。
随着分子生物学的不断发展，以dna为基础的分子标记(例如rapd,randomlyamplifiedpolymorphicdna；ssr,simplesequencerepeat；aflp,amplifiedfragmentlengthpolymorphism)已成为遗传分析的重要工具，被广泛应用于作物重要农艺性状基因定位、遗传图谱构建、品种指纹图谱与纯度鉴定及种质资源遗传多样性分析等方面的研究。与形态标记、细胞学标记和生化标记相比，基于dna的分子标记具有数量多涉及整个基因组、多态性高、不影响目标性状的表达及在植物的各个组织和发育时期均可检测不受季节和环境限制等优点。近年来，作为表达基因部分序列的est(expressedsequencetag)数据迅速增加，genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中公布的仅小麦est数据已达几十万条，这为小麦染色体特定区域的分子标记开发提供了大量有利资源。基于这些est开发的标记来源于基因编码区，直接反映了基因的表达信息，属于功能基因标记，为基因遗传分析与精细定位提供了更有力的工具。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于检测小麦中有无黄叶基因的专用引物，该引物扩增出的分子标记与黄叶基因yglw-1连锁，可通过该引物检测小麦中是否含有黄叶基因。
本发明还提供了包含上述引物的试剂盒，可以用于检测小麦中是否含有黄叶基因。
本发明还提供了上述引物在检测小麦黄叶基因及小麦育种中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于检测小麦中有无黄叶基因的专用引物，所述引物包括be494262、cd453721和/或bf202681；所述be494262的核苷酸序列为：
f-1：5’-tgacgtgacgaaaagtggag-3’，r-1：5’-cttcaatgattcccggaaga-3’；
所述cd453721的核苷酸序列为：
f-2：5’-ttttggtgttctttttgggg-3’，r-2：5’-ccagcttcttctcgcctcta-3’；
所述bf202681的核苷酸序列为：
f-3：5’-ttggttattcagtggtcaggtg-3’，r-3：5’-cgggtcaatgaaccattttt-3’。
本申请新发现的小麦黄叶基因yglw-1，与小麦早衰性状相关，含有该基因的植株在拔节期后表现为叶片黄化。在定位yglw-1基因的过程中发现3对引物与黄叶基因yglw-1连锁，这3对引物分别为be494262、cd453721和bf202681引物对，其扩增出的分子标记都与黄叶基因yglw-1连锁，遗传距离分别为2.8cm、5.8cm和6.2cm。用这3对引物对待测小麦基因组dna进行pcr扩增，如果扩增的特异条带分别为420bp、1500bp和580bp，表明待测小麦含有黄叶基因。可以通过这3对引物检测小麦样本中是否含有黄叶基因，进而在早期对小麦进行育种。这3对引物可以单独使用或者组合使用，3对共同使用时检测准确率更高。
用于检测小麦黄叶基因的试剂盒，该试剂盒包含上述引物。所述试剂盒还可以包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。所述dna聚合酶为taqdna聚合酶。
上述的引物或者试剂盒在小麦育种中的应用。具体的，以待测样本dna为模板，使用所述引物进行pcr扩增，根据扩增结果判断待测样本是否含有黄叶基因。然后根据所述黄叶基因的检测结果，弃去含有黄叶基因的样本，保留不含有黄叶基因的样本进行育种。含有黄叶基因的小麦在拔节期后会表达黄叶基因，小麦叶子发黄，影响生长发育，因此弃去含有黄叶基因的小麦样本。选育可在早期进行，可缩短育种周期。
更为具体的，当所述引物为be494262时，如pcr扩增出420bp的特异条带，则表明待测样本含有黄叶基因，如没有扩增出该特异条带，则表明待测样本不含有黄叶基因；
当所述引物为cd453721时，如pcr扩增出1500bp的特异条带，则表明待测样本含有黄叶基因，如没有扩增出该特异条带，则表明待测样本不含有黄叶基因；
当所述引物为bf202681时，如pcr扩增出580bp的特异条带，则表明待测样本含有黄叶基因，如没有扩增出该特异条带，则表明待测样本不含有黄叶基因。
上述3对引物扩增出的片段大小420bp、1500bp、580bp均为估测值，三个片段的实际大小应在420bp、1500bp、580bp附近。
所述pcr扩增的体系为20μl，包含10×buffe2.0μl，2.5mmol/ldntps0.6μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10μmol/l引物各1.0μl，30ng/μldna模板2.0μl，ddh2o13.2μl。
所述pcr扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延长5min。
经所述pcr扩增得到的扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。分离后进行银染然后观察。
本发明的检测小麦黄叶基因的3对引物可有效检测黄叶基因的有无，可用于育种早代选择，缩短育种周期，提高育种效率，具有操作简单成本低廉等优点。
附图说明
图1为苗期和成株期正常小麦与含有黄叶基因小麦叶片状态对照图；
图2为引物be494262在双亲、黄叶基因池和正常基因池、中国春及中国春缺四体材料(n2b-t2d和n2d-t2b)的pcr扩增产物电泳分离图；
图3为引物cd453721在双亲、黄叶基因池和正常基因池、中国春及中国春缺四体材料(n2b-t2d和n2d-t2b)的pcr扩增产物电泳分离图；
图4为引物bf202681在双亲、黄叶基因池和正常基因池、中国春及中国春缺四体材料(n2b-t2d和n2d-t2b)的pcr扩增产物电泳分离图；
图5为引物be494262在(yglw-1×cf5019-21)f5群体部分黄叶植株和正常植株的pcr扩增产物电泳分离图；
图6为引物cd453721在(yglw-1×cf5019-21)f5群体部分黄叶植株和正常植株的pcr扩增产物电泳分离图；
图7为引物bf202681在(yglw-1×cf5019-21)f5群体部分黄叶植株和正常植株的pcr扩增产物电泳分离图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。本发明中涉及的小麦材料cf5019-21是从“百农58409/财富麦”衍生后代中选择得到的优良品系，其叶片表现正常。百农58409和财富麦是河南科技学院小麦研究中心保存的小麦种质材料。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1
本发明中所用引物的设计及筛选过程。
(1)黄叶小麦材料的获得及其主要农艺性状
从“百农58409/财富麦”杂交后代中选择获得一个自然突变的黄叶突变体yglw-1。其在小麦拔节期底部叶片开始变黄，且黄叶性状逐渐向植株上部蔓延，一直持续到成熟。与其姊妹系cf5019-21(叶色正常)相比，yglw-1的穗长、穗粒数和千粒重显著降低(参见表1)。
表1黄叶突变体yglw-1与其姊妹系cf5019-21的主要农艺性状比较
*表示在0.05水平存在显著差异
(2)黄叶突变体yglw-1的遗传分析
用黄叶突变体yglw-1与其姊妹系cf5019-21杂交获得f1种子，f1自交获得f2分离群体。f1植株叶片表现正常，f2植株出现性状分离，488个f2植株中正常植株与黄叶植株分别为355和133株，其比例符合3:1(χ2＝1.32<3.84)，表明yglw-1受一对隐性核基因控制。其中正常与黄叶植株照片如图1所示，正常植株叶子绿色不发黄，黄叶植株叶子发黄。
(3)获得分子标记的方法
用黄叶突变体yglw-1与其姊妹系cf5019-21杂交获得f2分离群体。参照michelmore等提出的群体分离分组法筛选连锁标记。从f2植株中分别选取10个叶色正常和10个黄叶植株等量dna混合构建正常基因池和黄叶基因池。以黄叶突变体yglw-1与小麦正常品系cf5019-21及两个基因池为模板，进行pcr扩增及电泳分析筛选分子标记。引物序列来自graingenes2.0(http://wheat.pw.usda.gov/)，由上海生工生物技术有限公司合成。获得的多态标记进一步利用f2分离群体进行连锁分析，利用mapmarker3.0软件计算标记与基因间的遗传距离。
pcr反应体系为20ul，包含10×buffer(mg2+)2.0μl，2.5mmol/ldntps0.6μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10μmol/l引物2.0μl，30ng/μldna模板2.0μl，ddh2o13.2μl。
est-sts引物的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延长5min。扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察。
分子标记筛选结果表明，est-sts引物be494262(图2)、cd453721(图3)和bf202681(图4)在两个亲本和两个基因池间表现多态扩增。图中，m为100bpdnaladder，p1为黄叶突变体yglw-1，p2为正常亲本cf5019-21，b1为黄叶dna池，b2为正常dna池，1-3分别为中国春、n2b-t2d(缺失了小麦的2b染色体，增加了一对2d染色体)和n2d-t2b缺失了小麦的2d染色体，增加了一对2b染色体)。箭头所指分别为在黄叶突变体和正常植株扩增的标记带。在中国春缺四体材料n2b-t2d(缺失了小麦的2b染色体)中未扩增出黄叶突变体和正常植株的标记带，证实了引物be494262、cd453721和bf202681是位于小麦2b染色体上。这3对引物的序列、染色体位点和退火温度如表2所示。
对3个分子标记在f2群体的分离进行χ2检验，符合1:2:1的分离比例(如表3所示)，说明be494262、cd453721和bf202681扩增的黄叶基因标记带可以作为定位黄叶基因的分子标记。
根据软件mapmarker3.0分析计算，引物be494262、cd453721和bf202681扩增的分子标记与黄叶基因yglw-1连锁，遗传距离分别为2.8cm、5.8cm和6.2cm。它们在黄叶突变体扩增的特异条带分别为420bp、1500bp和580bp。
表2筛选出的与黄叶基因连锁的est-sts引物序列和退火温度
表3f2群体中yglw-1基因与est-sts标记的分离与χ2测验
实施例2
本实施例中的用于检测小麦黄叶基因的引物，其核苷酸序列为：
f-1：5’-tgacgtgacgaaaagtggag-3’，r-1：5’-cttcaatgattcccggaaga-3’。
本实施例中的试剂盒包含上述引物，还包括10×buffer(mg2+)，dntps和taqdna聚合酶。
使用上述的引物检测小麦黄叶基因，具体包括：
1)提取实施例1中(yglw-1×cf5019-21)f5群体部分黄叶植株和正常植株的基因组dna；
2)以待测样本dna为模板，使用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为20ul，包含10×buffer(mg2+)2.0μl，2.5mmol/ldntps0.6μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10μmol/l引物2.0μl，30ng/μldna模板2.0μl，ddh2o13.2μl。
pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延长5min。扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察。
结果如图5所示，其中样本1-10为黄叶植株，其在420bp处具有条带(见箭头处)，表明含有黄叶基因；样本11-20在420bp处没有该条带，表明不含有黄叶基因。弃去1-10，保留11-20样本。
实施例3
本实施例中的用于检测小麦黄叶基因的引物，其核苷酸序列为：
f-2：5’-ttttggtgttctttttgggg-3’，r-2：5’-ccagcttcttctcgcctcta-3’。
本实施例中的试剂盒包含上述引物，还包括10×buffer(mg2+)，dntps和taqdna聚合酶。
使用上述的引物检测小麦黄叶基因，具体包括：
以实施例2中的待测样本dna为模板，使用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为20ul，包含10×buffer(mg2+)2.0μl，2.5mmol/ldntps0.6μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10μmol/l引物2.0μl，30ng/μldna模板2.0μl，ddh2o13.2μl。
pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延长5min。扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察。
结果如图6所示，与实施例2相同，其中样本1-10在1500bp处具有条带(见箭头处)，表明含有黄叶基因；样本11-20在1500bp处没有该条带，表明不含有黄叶基因。弃去1-10，保留11-20样本。
实施例4
本实施例中的用于检测小麦黄叶基因的引物，其核苷酸序列为：
f-3：5’-ttggttattcagtggtcaggtg-3’，r-3：5’-cgggtcaatgaaccattttt-3’。
本实施例中的试剂盒包含上述引物，还包括10×buffer(mg2+)，dntps和taqdna聚合酶。
使用上述的引物检测小麦黄叶基因，具体包括：
以实施例2中的待测样本dna为模板，使用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为20ul，包含10×buffer(mg2+)2.0μl，2.5mmol/ldntps0.6μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10μmol/l引物2.0μl，30ng/μldna模板2.0μl，ddh2o13.2μl。
pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延长5min。扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察。
结果如图7所示，与实施例2、3相同，其中样本1-10在580bp处具有条带(见箭头处)，表明含有黄叶基因；样本11-20在580bp处没有该条带，表明不含有黄叶基因。弃去1-10，保留11-20样本。
<110>河南科技学院
<120>一种用于检测小麦中有无黄叶基因的专用引物、试剂盒及其应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物f-1
<400>1
tgacgtgacgaaaagtggag20
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物r-1
<400>2
cttcaatgattcccggaaga20
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物f-2
<400>3
ttttggtgttctttttgggg20
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物r-2
<400>4
ccagcttcttctcgcctcta20
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物f-3
<400>5
ttggttattcagtggtcaggtg22
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物r-3
<400>6
cgggtcaatgaaccattttt20