本发明属于药用植物分子鉴定
技术领域：
，具体涉及到一种用于阔叶山麦冬鉴别的特异性分子标记lpmi001。
背景技术：
：麦冬始载于《神农本草经》，列为上品，具有养阴生津、润肺清心的功效，属常用的滋阴药材。现代药理研究表明山麦冬功效与麦冬相似，均具有增强免疫力、抗心肌缺血和梗塞、降血糖和抗肿瘤等作用，但在主治、用法用量等方面有一定的差别。中国人民共和国药典(2015年版)以百合科山麦冬属植物湖北麦冬liriopespicata(thunb.)lour.var.proliferay.t.ma或者短葶山麦冬liriopemuscari(decne.)baily的干燥块根为正品山麦冬(liriopesradix)收载；以沿阶草属植物麦冬ophiopogonjaponicas(l.f)ker-gawl.的干燥块根为正品麦冬(ophiopogomisradix)收载。阔叶山麦冬(liriopeplatyphyllawangettang)同属于山麦冬属，阔叶山麦冬植株外形和普通麦冬容易区别，但是阔叶山麦冬的块根与正品麦冬极为相似，常作为商品麦冬在市场流通，因此有必要对其进行鉴定以与正品麦冬相区别，以保证麦冬药材的用药安全。截止本发明，虽然有从形态标记、生理生化、细胞显微切片和rapd标记等多方面关于阔叶山麦冬鉴别的研究报道，但均未找到一种准确高效的阔叶山麦冬鉴别方法。技术实现要素：本发明的一个目的是为了改善上述问题，提供一种用于阔叶山麦冬鉴别的特异性分子标记lpmi001。本发明开发了一种鉴别阔叶山麦冬的特异性分子标记引物，其特征在于该引物核苷酸序列如下：上游引物lpmi001-f：5’-cggtgggttgctaagactgta-3’，如seq.idno1所示；下游引物lpmi001-r：5’-ggtttcttgccaacatgggta-3’，如seq.idno2所示。此对特异性分子标记引物是采用普通pcr技术，利用微卫星标记对普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬等植株样品dna进行扩增，对扩增产物进行电泳，筛选阔叶山麦冬特异性条带进行测序，然后对测序获得的阔叶山麦冬特异条带序列进行比对，并以此设计特异性引物(lpmi001-f/r)。该引物对具有极高的专一性，用此对引物对普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬等植株进行pcr扩增，只有阔叶山麦冬能获得1893bp的dna条带，而普通麦冬和其他山麦冬没有；阔叶山麦冬扩增得到的特异片段核苷酸序列如seq.idno3所示。本发明的另一个目的是提供利用上述特异性分子标记引物对普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬进行快速鉴定的方法。本发明采用上述特异性分子标记引物(lpmi001-f/r)作为特异性扩增引物，以待普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬样本基因组dna为模板，进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现一条1893bp的dna条带，则待测样本为阔叶山麦冬；若电泳结果未出现一条1893bp的dna条带，则待测样本为普通麦冬和山麦冬。上述方法中扩增引物的选择、基因组dna的提取确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。需要说明的是，本发明特异性性分子标记引物和检测方法仅适用于从众多普通麦冬和山麦冬样本中进行阔叶山麦冬的鉴别，即待测样本是限定为普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬样本的范围内，本领域普通技术人员采用本发明方法可对阔叶山麦冬进行的快速鉴定，方法简便、准确、快速，是其他现有鉴别方法不能实现的。具体的所述方法如下：(1)取待测普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬样本新鲜叶片0.3-0.5g，加入液氮研磨，利用植物基因组dna提取试剂盒提取待测样本的基因组dna；(2)以步骤(1)所得的基因组dna为模板，以所述特异性分子标记引物(lpmi001-f/r)为扩增引物，进行普通pcr扩增：pcr反应体系(总体积为20μl)组成如下：体系组分体积(μl)10×pcrbuffer(含mg2+)210mmol/ldntps0.620μmol/l上游引物0.520μmol/l下游引物0.55u/μltaq酶0.4dna模板(50ng/μl)1ddh2o15pcr反应程序为：94℃预变性8分钟；30个循环(94℃变性30秒，退火温度55℃复性45秒，72℃延伸100秒)；最后72℃延伸8分钟。(3)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得的pcr扩增产物，利用凝胶成像系统进行成像拍照，若电泳结果出现一条1893bp的dna条带，则待测样本为阔叶山麦冬个体；若电泳结果未出现一条1893bp的dna条带，则待测样本为普通麦冬和山麦冬。本发明的有益效果主要体现在：本发明的特异性分子标记引物(lpmi001-f/r)可从众多普通麦冬和山麦冬样本中进行阔叶山麦冬的分子鉴定，方法简单、准确、高灵敏度，是其他现有鉴别方法不能达到的。附图说明图1为采用本发明的特异性分子标记对普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬个体进行pcr扩增后的电泳图；其中通道m为dna标准分子量markerdl2000；通道1～25：(1)川麦冬1、(2)西山三年生浙麦冬、(3)崇寿一年生浙麦冬、(4)九塘二年生浙麦冬、(5)八塘一年生浙麦冬、(6)建伍二年生浙麦冬、(7)曹娥二年生浙麦冬、(8)崇寿六年生浙麦冬、(9)崇寿三年生浙麦冬、(10)安吉山麦冬、(11)慈溪胜山一年生浙麦冬、(12)磐安细叶麦冬、(13)磐安麦冬、(14)慈溪胜山镇三年生浙麦冬、(15)萧山麦冬、(16)浙江衢州麦冬、(17)川麦冬2、(18)川麦冬3、(19)磐安阔叶麦冬、(20)下沙麦冬、(21)富阳山麦冬、(22)胡金张浙麦冬、(23)珠江村浙麦冬、(24)曹娥浙麦冬、(25)建伍浙麦冬。具体实施方式以下实施例是对本发明的具体实施方式作进一步详述。实施例1.1.待测普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬样本基因组dna提取取待测普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬样本的新鲜叶片0.3-0.5g，加入液氮在研钵中研磨至粉末，然后使用上海生物工程技术有限公司的ezup柱式植物基因组dna抽提试剂盒提取待测普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬样本基因组dna，用1.5％琼脂糖凝胶对所得dna进行电泳以检测纯度，并利用美国赛默飞世尔公司的nanodroptm1000型超微量紫外分光光度计检测dna浓度，然后稀释至50ng/μl，4度冰箱放置备用。2.合成特异性分子标记引物设计基于阔叶山麦冬特异序列的分子标记引物，上游引物lpmi001-f:5’-cggtgggttgctaagactgta-3’和下游引物lpmi001-r:5’-ggtttcttgccaacatgggta-3’，由上海生工合成。3.特异性分子标记引物(lpmi001-f/r)的pcr扩增pcr扩增体系(总体积20μl)：10×pcrbuffer(含mg2+)2μl，10mmol/ldntps0.6μl，20μmol/l上游引物0.5μl，20μmol/l下游引物0.5μl，5u/μltaq酶0.4μl，dna模板(50ng/μl)1μl，ddh2o15μl。pcr反应程序为：94℃预变性8分钟；30个循环(94℃变性30秒，退火温度55℃复性45秒，72℃延伸100秒)；最后72℃延伸8分钟。4.电泳检测取步骤(3)pcr扩增产物5～10μl，利用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果如图1所示。按照上述方法，利用特异性分子标记lpmi001对普通麦冬、山麦冬和阔叶山麦冬个体进行检测，电泳图见图1，其中编号为19的为阔叶山麦冬个体，扩增出一条1893bp的dna条带；其他编号为普通麦冬和山麦冬个体，均无扩增出一条1893bp的dna条带。这表明本发明的特异性分子标记lpmi001具有极高的专一性，因此可以用于阔叶山麦冬的快速鉴定。序列表<110>杭州师范大学<120>用于阔叶山麦冬鉴别的特异性分子标记lpmi001<130>1<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>1cggtgggttgctaagactgta21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>2ggtttcttgccaacatgggta21<210>3<211>1893<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>3cggtgggttgctaagactgtagcagtggcctgttcctgaagagcagcatcatcttgcgtc60tcctctgcaaggcgacgagatcagaaattagccagggcctcggacttctgaatcagctct120gactagatgacattgcattgatcaaccaagtcggccttcctctgaccttgggaagacaga180tggggtttctgctcttccaagcggatttgcagttaagctatggtgttacctgtatgaaca240atggcttcaagagtttggcgctccgactcttctgcgagtcgatgatcgtcgagcagttgg300ccataagtctcgcgtgaagcttcaagatgagcagtcatcgcattctcctcttgccgagct360tgttctaaaaatcgagtacgccgtgagcgcgcctcgatgcaagccaactttatcaagccc420tcaatattggcgttgttcaggtcttctaggcatttgaggtcagtccctagctggtgaatc480tctgactcatattgtgcagctgtgtgatcatcgccaagcagtttgatattctcaatgtaa540cttgagagtagaggatacatggcctcaaaagatccctggtcatacgtcacaagacgaata600gtctcttccatcatggagttcagctggtctaccaagttcttgactaaaaaaccaacggta660gttggggttaagcatcgggaaagagagacaggccgaggaatataaggggacacgagacct720ggcaattgaatcgcagcggagctggatggaatggtcggccgagaatgagtggacgacact780gaaaatttgaagctctggagtgttggggtcgtgttagaaggacctgtgggagactcacga840gtcgatggaataatcggttgaaggctaagttcaattgacataggtcgttgagctaattcc900cccaggagagctggcggcgcggaagatgcccctgccaggaagccagggtcgatcctcgct960aattctgcatggattccttcaagatgaggagcttgagatgctgccaataaagggtaaaac1020attagcttatgcaagttaagaataaaggatgaaaatagaaaggaaacattacctccggaa1080aagacggtgctgataagaggcggtttagttgtctgttcaatggaaaaagcctgaggatca1140gagccagatggccggccagcctctatatcgtcgtacatatcattccagctggatctgtca1200ctataatttataggagatgatctggcagcttcagcagttgaggtgatgatcggtacctga1260cactggaagcaccggcagtgttaacatgctgcgtcaggtcctgaatgaagatgcctgtag1320tagggctggactgcgtttggggccccattaggacaagagctgaggaaattggaggatcag1380atcctttgagtaaaagccctttaccctttccagtaacttctggcctgggctcttggtggg1440gaggagtggtccttcccaagacaagccaacctcttcgaggagggagggaatcaaatgcat15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