本发明涉及植物学技术领域，具体涉及一种油茶树mirna及其应用。
背景技术：
油茶是起源于中国的一种重要的木本油料植物，可以从其籽仁中获得茶油。茶油是具有药用价值的食用油，含有高达90％的不饱和脂肪酸(包括油酸、亚油酸和棕榈酸)和少量的饱和脂肪酸，由于其脂肪酸组成与橄榄油类似，因此被称为“东方橄榄油”。油茶果实成熟过程是营养成分的合成和贮存过程，其中油脂是重要营养积累物质之一，其含量的高低和脂肪酸品质的好坏将直接关系到油茶经济价值的高低。在油茶果实成熟过程中，油酸相对含量逐渐上升，而亚油酸的相对含量则呈下降趋势。目前，从油茶树中已克隆得到油脂合成相关基因，如bccp、ech和fad8等，但油茶的分子基础研究较弱，尤其是决定油茶产量和品质的分子机制，因此油茶中油脂合成的相关研究还处于探索阶段。
microrna(mirna)是一类大小约22nt非编码的单链分子，通过碱基互补配对的方式识别靶mrna，并根据互补程度的不同导致靶mrna的降解或翻译抑制，从而起到在转录和转录后水平上对基因表达进行负调控的作用。植物mirna的作用方式主要为剪切靶基因，大多数植物mirnas前体(pri-mirna)来自其自身的转录单元，由rnapolymeraseii(polii)转录而成，经过细胞核内的组装和酶催化作用后以mirna:mirna*形式转运至细胞质中，其中mirna*被小rna降解酶(sdn)降解，另一条功能成熟甲基化的mirna与ago蛋白(argonaute)形成rna诱导的沉默复合体(risc)。risc中的ago1蛋白可直接切开与mirna第10或11位互补的碱基，形成小片段并降解靶mrna，进而导致靶基因的降解。
有研究表明，mirna在植物的生长、胚的发育、器官的发育与成熟及抗逆性中起着重要作用。目前，已经有223个物种、28645条前体的mirna和35828条成熟mirna收录在mirbase21.0(http://www.mirbase.org/)，研究对象主要集中在草本植物拟南芥和高粱、禾本科水稻和玉米等，而对木本植物的报道较少，尤其关于油茶树的mirna。由于油茶的基因背景信息相对缺乏，到目前为止被发现和进行预测分析的油茶树mirna仅是少量的，其中参与油脂合成的有mir5067、mir2118、mir482和mir1861。
因此，有必要进一步挖掘和鉴定油茶树中功能性的mirna，尤其是调控油脂合成和代谢的mirna，从分子水平上探索油茶果实累积油脂的机制，改善油茶产量和品质。
技术实现要素：
由鉴于此，本发明的目的在于提出一种油茶树mirna及其应用，该油茶树mirna能够调控油茶树丁醇脱氢酶(butanoldehydrogenase)的表达，即该油茶树mirna能够调控催化13-羟基十八碳二烯酸(13-hydroxy-octadecadienoicacid,13-hode)生成13-氧代-十八碳二烯酸(13-oxo-octadecadienoicacid,13-oxoode)的过程，在改善油茶产量和品质中具有潜在的应用价值。
基于上述目的，本发明提供的一种油茶树mirna及其应用，所述油茶树mirna为mir156，所述mir156的碱基序列如seqidno.1所示。
本发明通过hiseq2500高通量测序平台和生物信息学分析等技术，首次从油茶湘林210号中鉴定了mir156，通过荧光定量pcr验证mir156及其靶基因表达的差异，得出亚油酸代谢与mir156呈显著负相关关系的结论，并通过靶基因功能分析发现本发明mir156对油茶果实成熟过程中亚油酸代谢途径内丁醇脱氢酶的表达具有重要调控作用，在改善油茶产量和品质中具有潜在应用价值。
在本发明的一些实施例中，所述mir156的上游引物碱基序列如seqidno.3所示，所述mir156的下游引物碱基序列如seqidno.4所示。
在本发明的一些实施例中，所述mir156的靶基因碱基序列如seqidno.2所示，所述靶基因的上游引物碱基序列如seqidno.6所示，所述靶基因的下游引物碱基序列如seqidno.7所示。
本发明中所述mir156的靶基因为cl15005.contig2_all。所述mir156作用于靶基因cl15005.contig2_all，靶基因cl15005.contig2_all经表达能产生催化13-羟基十八碳二烯酸生成13-氧代-十八碳二烯酸的丁醇脱氢酶，且mir156和靶基因cl15005.contig2_all的表达呈显著性负相关性。因此，mir156对油茶果实成熟过程中亚油酸代谢途径内丁醇脱氢酶的表达具有重要调控作用，从而能够通过调控mir156的表达改善油茶的产量和品质。
基于相同的发明构思，本发明还提供了油茶树mirna在调控亚油酸代谢中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述mir156调控丁醇脱氢酶的表达。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明mir156通过作用于靶基因cl15005.contig2_all而能够调控油茶果实中丁醇脱氢酶的表达，进而mir156在调控13-羟基十八碳二烯酸生成13-氧代-十八碳二烯酸的过程中起到重要作用，油茶树mir156的表达可调控油茶果实成熟过程中亚油酸的代谢，在改善油茶的产量和品质中具有潜在应用价值。
附图说明
图1为亚油酸代谢的keggpathway图；
图2为mir156及靶基因cl15005.contig2_all在油茶树果实和花中的相对表达量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1mirna的筛选和鉴定
1.1植物材料和样品的准备
以湖南省永州市冷水滩区湖南科技学院油茶基地湘林210号油茶品种为试验材料，采用s型采样法分别采摘10月份和7月份的果实，液氮速冻后，-80℃下冷冻备用。
1.2油茶树mirna的高通量测序
采用trizol法提取油茶树rna
(1)分别取油茶树花和果实各0.1g置于研磨中，立即加入液氮研磨至细粉状；
(2)将上述花和果实粉末分别移至用depc处理的1.5ml离心管中，随后分别加入1000μltrizol试剂，充分混匀后于冰上静置5min；
(3)向步骤(2)处理后的离心管中分别加入200μl的氯仿后盖紧离心管，用力摇动15s，使离心管中的物质充分混匀，静置5min后于4℃下12000r/min离心15min；
(4)离心完成后，分别吸取离心管上层水相500μl，然后分别转入新的离心管中，再加入等体积的异丙醇，充分混匀后于室温静置10min，4℃下12000r/min离心10min；
(5)分别去掉步骤(4)处理后的离心管中的上清液，然后分别向离心管中加入1ml现配的75％乙醇振荡洗涤沉淀一次，4℃下7500r/min离心5min；
(6)分别去掉步骤(5)处理后的离心管中的上清液，然后将留有沉淀的离心管置于超净台内风吹10min后再分别加入30μl经depc处理的双蒸水进行溶解；
(7)通过琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度以及是否有污染；通过nanodrop检测rna的纯度，即od260/od280的比值；通过qubit荧光计对rna浓度进行精确定量；采用agilent2100精确检测rna的完整性。样品检测合格后，使用smallrnasampleprekit构建文库，然后采用illuminahiseqtm2000平台进行高通量测序，交由浙江天科高新技术发展有限公司完成，获得18～40nt的mirna序列。
1.3mirna的鉴定
首先对采用illuminahiseqtm2000平台进行高通量测序得到的rawreads数据进行处理后得到cleanreads，处理的具体步骤如下：(1)去除低质量reads，即去除质量值sq≤5的碱基数占整个read的50％以上的reads；(2)去除n的比例大于10％的reads，即去除无法确定碱基信息的比例大于10％的reads；(3)去除有5’接头污染的reads；(4)去除没有3’接头序列和插入片段的reads；(5)trim掉3’接头序列；(6)去除polya/t/g/c的reads，由于大部分连续的polya/t/g/creads可能来源于测序错误，且信息熵低，因此可以不做分析。接着将所得到的cleanreads序列与mirbase21.0数据库中已知植物转录组数据进行blast比对，将比对到的油茶树est序列进行二级结构分析，如果形成mirna前体(pre-mirna)所具有的稳定茎环结构则认为该序列为油茶树的mirna。通过该方法，鉴定出油茶树的mir156，其成熟序列如seqidno.1所示，其序列为：uugacagaagauagagagc。
并且，mir156的前体即pre-mirna的序列如seqidno.8所示，其序列为：gggcactggtggtgatgttgttgacagaagatagagagcacagatgatgatatgcaatta。
mir156及其前体pre-mirna的序列如表1所示，
表1。
1.4mir156靶基因的预测
采用在线预测软件程序psrobot_tart(http://omicslab.genetics.ac.cn/psrobot/target_prediction_1.php)预测并注释油茶树的靶基因，获得mir156对应的靶基因为cl15005.contig2_all，靶基因序列如seqidno.2所示，其序列为：
caagtgggtatggatcaaactcaacagctgagcaagttactcagcattcttcttcttcttccttactcccttctcatcatctcactgcaattgtcactggtgcaacatcaggcattggggctgaaacagcaagaatattagcaaagagaggtgtgaggattgtgattccagcaagagatttgaagaaagctactgaagtaaaggaatgtatccaaaaggagagtccagaggctgagattgtattattggagattgatctaagctcattagcttctgtcaagagattttgttctgagttcttgtctctaggattaccccttaatcttctcataaacaatgccgggaaattttcacaaaagttggagttctctgaagacaaagttgagatgacttttgctacaaactacttgggtcattttatgttgacagaattattgttagagaagatggtggagacagcagcacatactggtattcaaggaaggattattaatgtttcttctgtaattcatagctgggtgaaaccagaaactttctgcttcaaccaattgcttaatccaaacaactataacggcactgatgcatacgctcaatccaaactagccaacatattgcataccaaggaaatcgcaagacagcttaaggcaagaaatgcaagagtaaccatgaatgcagtacacccaggaattgtgaagactggcatcatcagagaccacaaaggattcgtcacagattctgtgtttttcctcacatccaaactactaaaaacaacaccccagggtgcatcaacaacctgctatgttgcactaagccaacaaacagaaggagtgagtgggaagtactttgcagattgcaatgaaagcaactgttcagcccttgcaaatgatgaatctcaagcccacatgctctggaagcagacccgtgcactgatccgtacacgattacgtcaaccagtaacttaatagaaacataaaaatcaattacagaactctacataaccttctcatacaagatgggttgctattgggcctagctcttactgagctatttccaagccgtaaaacaacatgacaaatagtgctaataaattgttgcgttttgtcatgtgtgcctgttgccacaagaagtgcattagggtacacgttgcaaagccacgattgaggcaaaggcatctctccaaactttacaactgtccgagcttttggccgcataagactgagacccgcctcatatgagagagttatgtttgattttgtgattagttatttgtgtttaaaaaaaaaaattagttgcagtcatacatatacatgaaataattatgttgtatatatctacttctagagaaggtatatatacactatggtacatgaaaataaagagcctaccctgtcagcattgtccctaaaatattgttcctccacttgagaagctatattttgaataacagaagtgtaaacatttacgtaaaaa。
mir156及靶基因cl15005.contig2_all的位点片段如表2所示，
表2。
实施例2油茶树mir156在调控亚油酸代谢中的应用
2.1油茶果实中脂肪酸的提取
采用索氏抽提法提取油茶果实中的脂肪酸。称取2g粉末状油茶籽，置于滤纸筒内，用脱脂棉将其上部压紧密封后用棉线系紧，置于索氏抽提器内，加入180ml石油醚，88℃下提取6h后再经蒸空浓缩溶剂后得到的物质即为茶油。
2.2茶油中脂肪酸组成分析
样品甲酯化预处理：取2～3滴茶油样品放入干净的试管底部，加入2.0ml0.5mol/l的氢氧化钠-甲醇溶液，充分摇匀，于60℃下水浴30min，然后加入5ml正己烷，混匀，静置片刻至溶液分层，吸取上层溶液进行gc-ms分析。
采用岛津qp2010s型气质联用仪分析茶油的脂肪酸组成。
gc检测条件如下：
色谱柱为石英毛细管柱hp-5(30m×0.25mm×0.25μm)；氢火焰离子化检测器(fid)；进样口温度为25℃；进样量为1.0μl，分流比为20:1；载气为高纯氦气，流速为1.0ml/min；程序升温为：初始温度180℃，保持5min，以3℃/min升温速率升至230℃，保持15min。
ms检测条件如下：
采用电子电离(electronionization，ei)离子源，电子能量为70ev；离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；传输线温度为280℃；质量范围为30～450u，全扫描方式；溶剂延迟3min。
2.3总rna的提取
油茶树的总rna的提取和质量检测参照实施例1进行。
2.4qrt-pcr检测mir156及对应靶基因cl15005.contig2_all的表达
2.4.1试剂及仪器
试剂：rna酶抑制剂、m-mlv逆转录酶、10mmdntpmix、sybrgreenqpcrsuper-mix-udgwithrox、rnase-freewater；其中重组rna酶抑制剂、m-mlv逆转录酶、10mmdntpmix购自takara公司，sybrgreenqpcrsuper-mix-udgwithrox购自invitrogen公司，rnase-freewater购自ambion公司；
仪器：常温离心机(thermo)、微量紫外分光光度计(nanodrop2000-thermo)、荧光定量pcr仪(abisteponeplus)。
2.4.2mir156反转录合成cdna
采用primer3(primer3-2.3.7，默认参数)进行ssr设计反转录引物rtprimer，rtprimer碱基序列如seqidno.5所示，其碱基序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgctctc，
配制下列反应混合液(6.0μl)：
70℃下孵育10min，然后在冰上吸附3min，得到6.0μl变性的总rna和rtprimer；配制以下反转录反应液(10.0μl)：
42℃反应1h后，70℃反应15min，反应完成后，加入15μlrnase-freewater进行稀释，然后置于8℃的冰箱内备用。
2.4.3靶基因cl15005.contig2_all反转录
配制下列反应混合液(6.0μl)：
70℃下孵育10min，然后在冰上吸附3min，得到6.0μl变性的总rna和rtprimer；配制以下反转录反应液(10.0μl)：
42℃反应1h后，70℃反应15min，反应完成后，加入15μlrnase-freewater进行稀释，然后置于8℃的冰箱内备用。
2.4.3sybr荧光定量pcr
反转录得到油茶树cdna第一链，以cdna第一链为模板，然后采用sybrgreenqpcrsuper-mix-udgwithrox，使其引物与模板正确结合随后使用dna聚合酶i和rnaseh(promega，madison，wi)进行随机引物和第二链cdna合成mir156的上游引物和下游引物，mir156的上游引物mir156-f碱基序列如seqidno.3所示，mir156的下游引物mir156-r碱基序列如seqidno.4所示，靶基因cl15005.contig2_all的上游引物cl15005-f碱基序列如seqidno.6所示，靶基因cl15005.contig2_all的下游引物cl15005-r碱基序列如seqidno.7所示，引物序列参照表3所示：
表3。
配制20.0μl的定量体系：
反应条件如下：
pcr反应在50℃下持续2min，95℃进行5min，然后在95℃孵育，持续15s，最后在60℃持续31s，重复40次。
每个样品重复3次，以ef1a2为内参，数据分析采用2^(-δδct)方法进行分析，通过ef1a2表达水平对每个mirna的相对表达量进行归一化处理，fold-change采用2-δδct方法进行分析，结果分别如表4和图2所示。
表4。
其中，δct＝目的基因ct值-内参基因ct值，δδct＝(group1δct)-(group2δct)，group1代表果实，group2代表花。foldchange＝2^(-δδct)，foldchange大于2显著上调，小于0.5显著下调，p-value小于0.05表示生物学重复有意义。
由图2可以看出，果实相对于花来比较，mir156在果实中的相对表达量明显小于花，而cl15005.contig2_all的相对表达量比花高。
2.4.4不同月份油茶果实中亚油酸相对含量测定
采用gc-ms分别测定七月份、八月份、九月份油茶果实中油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸的相对含量，结果如表5所示，
表5。
由表5中数据进行分析可以得出，亚油酸的相对含量与mir156呈显著性负相关关系，mir156能够调控油茶果实成熟过程中亚油酸的代谢。
由实施例1及实施例2可以看出，
本发明中所述mir156的靶基因为cl15005.contig2_all。所述mir156作用于靶基因cl15005.contig2_all，靶基因cl15005.contig2_all经表达产生催化13-羟基十八碳二烯酸生成13-氧代-十八碳二烯酸的丁醇脱氢酶，并且mir156和靶基因cl15005.contig2_all的表达呈显著性负相关，因此，mir156在调控丁醇脱氢酶表达中起到重要作用，mir156的表达能够调控油茶树中亚油酸的代谢，从而能够通过调控mir156的表达以改善油茶的产量和品质。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>湖南科技学院
<120>一种油茶树mirna及其应用
<130>fi180065-nd
<160>8
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>19
<212>rna
<213>油茶（camelliaoleifera）湘林210号
<400>1
uugacagaagauagagagc19
<210>2
<211>1470
<212>rna
<213>油茶（camelliaoleifera）湘林210号
<400>2
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