本发明涉及一种基于图位克隆原理针对植物基因组测序且分离群体为亚种间杂交的基因精细定位方法。
背景技术：
基因定位是图位克隆研究中的重要环节。图位克隆(map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning)，1986年首先由剑桥大学的alancoulson提出，用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，再利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选dna文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验验证该基因的功能。其中图位克隆方法在寻找杂交亲本之间的多态分子标记需要花费较多时间验证，甚至在染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆时无法得到可用的多态标记，导致基因工作无法开展；另一方面在基因的精细定位步骤中，需要较多分离群体中的突变体表型植株进行筛选重组子，扩大了人力物力成本。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于图位克隆原理针对植物基因组测序且分离群体为亚种间杂交的基因精细定位方法。
本发明提供了一种对植物基因组中决定目标表型的功能基因进行定位的方法，包括如下步骤：
(1)采用植株甲和植株乙为亲本，构建f2代分离群体；所述植株甲为具有所述目标表型的突变体植株；所述植株乙为与所述突变体植株属于同一种但不同亚种的植株；
(2)从步骤(1)得到的f2代分离群体中筛选若干具有所述目标表型的植株，然后将来源于各个植株的材料等质量混合后提取基因组dna，得到一个特异dna池；分别对所述植株甲、所述植株乙和所述特异dna池进行全基因组测序；
(3)将步骤(2)得到的各个全基因组测序结果与植物参考基因组进行比对；所述植物参考基因组为所述突变体植株属于同一种的植物的参考基因组；
(4)基于步骤(3)的比对结果进行定位分析，得到决定所述目标表型的功能基因在植物染色体上的物理位置。
所述步骤(2)中，所述“若干具有所述目标表型的植株”具体可为50株具有所述目标表型的植株。
所述步骤(4)中，所述定位分析包括如下步骤：(a1)获得所述植株甲和所述植株乙的植株之间的差异位点；(a2)基于所述特异dna池的全基因组测序结果，计算步骤(a1)得到的每个差异位点的遗传距离；(a3)从每条染色体的第一个碱基开始，在1mbp的物理距离内计算差异位点遗传距离的平均值，10kb物理距离向前滑动一次，通过利用r语言作图工具绘制每个差异位点的遗传距离点和差异位点遗传距离的平均值的趋势线，以小于10cm为基因连锁区域，峰形图谷底为紧密连锁区域，在10cm两侧为决定所述目标表型的功能基因的锚定区间。
所述步骤(a2)中，所述遗传距离＝野生型序列数/(突变体序列数+野生型序列数)×100。
所述步骤(a2)中，所述趋势线的位置坐标为1mbp位置中的起始位置和结束位置的平均值
所述方法中，利用r语言作图工具绘制每个差异位点的遗传距离和差异位点遗传距离的平均值的趋势线。
所述植株甲可通过多种方式获得，例如从现有突变体库购买具有所述目标表型的的突变体，也可为采用ems(甲基磺酸乙酯)诱变、伽玛射线诱变或者自然突变等方法筛选得到具有所述目标表型的突变体。
所述方法中，所述“一种对植物基因组中决定目标表型的功能基因进行定位的方法”具体可为“一种对水稻基因组中决定单分蘖表型的功能基因进行定位的方法”。
当所述方法为“一种对水稻基因组中决定单分蘖表型的功能基因进行定位的方法”时，所述植株甲具体可属于水稻种，更具体可属于水稻种粳稻亚种。所述植株甲可为以水稻kittake为出发植株的突变体植株，更具体可为以水稻kittake为出发植株，进行ems诱变得到的突变体植株。所述植株乙可属于水稻种，更具体可属于水稻种籼稻亚种。所述植株乙具体可为籼稻保持系q1b。所述植物参考基因组为水稻日本晴参考基因组。
本发明还保护一种用于对植物基因组中决定目标表型的功能基因进行定位的系统，包括全基因组测序仪器、序列比对软件和记载有以上任一所述方法的说明书。
所述系统还包括r语言作图工具。
本发明一种对植物基因组中决定目标表型的功能基因进行定位的方法，其特征在于：用“全基因组测序”代替图位克隆中的“分子标记筛选”。
本发明提供了一种基因精细定位方法。本方法的优点在于：(1)结果准确可靠：相对于回交群体，本方法亲本之间的差异位点极多，统计分析结果准确可靠；(2)节约时间：相对于传统的利用分子标记做pcr及电泳分析进行初定位和精细定位，其要花费1周或者数周的时间，如果两亲本之间遗传背景差异不大，可能无法进行初定位；本方法一般在2个小时即可完成初定位和精细定位分析，极大的节约了时间，其可以利用服务器同时进行多个基因定位分析；(3)节省人力：相对于传统的图位克隆方法，在精细定位时需要大量提取dna，本方法只需要提取3组dna即可，无需在图位克隆中大量提取dna的步骤。
本方法利用一个单分蘖的水稻材料mu1，其背景为粳稻，与籼稻背景的材料q1b杂交，利用基因组大规模测序的方法，把f2群体中的突变体表型池中dna序列模拟图位克隆中初定位和精细定位的方法，快速锚定基因的连锁区间。利用此方法得到的基因精细定位的区间与图位克隆产生的结果一致，验证了本方法的可行性。
附图说明
图1为水稻材料kittake和突变体mu1的表型观察结果。
图2为实施例1图位克隆法基因定位结果。
图3为1号染色体定位结果。
图4为2号染色体定位结果。
图5为3号染色体定位结果。
图6为4号染色体定位结果。
图7为5号染色体定位结果。
图8为6号染色体定位结果。
图9为7号染色体定位结果。
图10为8号染色体定位结果。
图11为9号染色体定位结果。
图12为10号染色体定位结果。
图13为11号染色体定位结果。
图14为12号染色体定位结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
水稻kittake(粳稻)：具有多分蘖表型；参考文献：李万昌,余娇娇,段灿星,等.灰飞虱胁迫下水稻防卫相关基因的表达[j].作物学报,2012,38(9):1625-1630.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
籼稻保持系q1b：背景为籼稻，具有多分蘖表型；可以从重庆市种子公司处购买。
实施例1、诱变获得表型突变株以及制备突变株与野生株的后代群体
一、诱变获得表型突变株
1、以水稻kittake种子为原始材料，进行ems诱变(取种子，先用清水浸泡16小时，再用0.5％的ems溶液浸泡8小时)。
2、将步骤1得到的种子播种并培育为植株，植株自交后收获种子(m1代种子)。
3、将步骤2得到的种子播种并培育为植株，植株自交后收获种子(m2代种子)。
4、将步骤3得到的种子播种并培育为植株，从中筛选出具有单分蘖表型的突变体一株，将其命名为突变体mu1。
插秧2个月后，水稻kittake和突变体mu1的表型照片见图1。
二、制备突变株与野生株的后代群体
1、突变体mu1(母本)和籼稻保持系q1b(父本)进行杂交，收获种子(f1代种子)。
2、将f1代种子播种并培育为植株，即为f1代植株，共获得5株f1代植株。f1代植株均具有多分蘖表型。
3、将f1代植株自交后收获种子，即为f2代种子。
4、将f2代种子播种并培育为植株，即为f2代植株，共获得1000株f2代植株，这些f2代植株组成f2代分离群体。
f2代分离群体中，多分蘖数单株数量：单分蘖单株数量＝740：260(约3：1)，因此确定该分蘖数性状是由隐性单基因控制。
实际应用中，可以采用任何现有方法获得突变体，例如可以从现有突变体库购买突变体，也可以采用ems(甲基磺酸乙酯)诱变、伽玛射线诱变或者自然突变等方法筛选得到理想的突变体。
实施例2、图位克隆基因定位
1、从实施例1获得的f2代分离群体中，随机取50株具有单分蘖表型的植株的叶片，将叶片等质量混合后提取基因组dna，得到单分蘖dna池。
2、初步定位
将步骤1构建的单分蘖dna池分别利用180对ssr标记进行pcr扩增，筛选得到一个与单分蘖表型紧密连锁的分子标记s2。
s2-f(5’-3’)：tataaggaaaagaacgctgc；
s2-r(5’-3’)：tgaaatcatgcaccattaac。
3、精细定位
在分子标记s2的上下游发展新的分子标记s1(位于1号染色体13m的位置，检测引物由引物s1-f和引物s1-r组成)和分子标记s3(检测引物由引物s3-f和引物s3-r组成)。
s1-f(5’-3’)：gacctagtggtcttcaatct；
s1-r(5’-3’)：cctccgctttctaagtttgaca；
s3-f(5’-3’)：tataaggaaaagaacgctgc；
s3-r(5’-3’)：tgaaatcatgcaccattaac。
分单株提取f2群体中突变体表型的单株dna，用3个ssr标记对其进行分析，最终把候选基因锚定在分子标记s1的s2之间(图2)，两者之间的物理距离为7.6mbp。
实施例3、基因组大规模测序基因定位
1、从实施例1得到的f2代分离群体中，随机取50株具有单分蘖数表型的植株的叶片，将叶片等质量混合后提取dna，得到单分蘖dna池。
2、分别对突变体mu1、籼稻保持系q1b和步骤1得到的单分蘖dna池进行全基因组测序(测序深度大于10倍的reads要覆盖基因组90％以上最佳)，分别获得突变体mu1的全基因组测序结果、籼稻保持系q1b的全基因组测序结果和单分蘖dna池的全基因组测序结果。
3、将步骤2得到的各个全基因组测序数据分别与水稻日本晴参考基因组进行比对(具体可采用bwa、gatk、samtools等软件进行比对和分析)。
4、定位分析
(1)基于步骤3的结果，获得突变体mu1和籼稻保持系q1b的差异位点汇总(包含差异序列、位置、测出相应的次数等)。此步骤类似于图位克隆中的找两亲本之间的多态分子标记。
(2)基于单分蘖dna池的全基因组测序结果，计算步骤(1)得到的每个差异位点的遗传距离。遗传距离＝野生型序列数/(突变体序列数+野生型序列数)×100。
(3)完成步骤(2)后，从每条染色体的第一个碱基开始，在1mbp的物理距离内计算差异位点遗传距离的平均值，10kb物理距离向前滑动一次，通过利用r语言作图工具绘制每个差异位点的遗传距离点和差异位点遗传距离的平均值的趋势线(其中趋势线的位置坐标为1mbp位置中的起始位置和结束位置的平均值)(图3-图14)，以小于10cm为基因连锁区域，峰形图谷底为紧密连锁区域，在10cm两侧为基因锚定区间。从图3-图14可以同时看出染色体区段的标记密度(绿色的点)和整体的趋势(红色的线)，使定位分析一目了然。
定位结果如图3-图14所示。图3-图14依次为1号染色体-12号染色体的基因定位结果，横坐标为染色体物理位置，以m(兆)为单位，纵坐标为遗传距离，在10cm处设置标尺，为基因连锁标准线。利用本方法最终将功能基因锚定于1号染色体13m-21m之间，从13m开始连锁，实施例1采用图位克隆的方法也能推断出基因锚定于13m-21m之间。利用此方法得到的基因精细定位的区间与实施例1中图位克隆法定位产生的结果基本一致。
利用商购的突变体或其他诱变方法得到的突变体进行功能基因定位，经过多次实验验证，采用实施例2的方法与实施例1传统图位克隆法均可得到一致的结果，验证了本方法的普适性。