本发明涉及微流控芯片技术与水生生态环境评价领域，尤其涉及一种基于微流控趋化芯片的水体富营养化指示方法。
背景技术：
各种迹象表明，人类活动正在干扰或改变地球上碳、氮、硫、磷等生源要素的生物地球化学循环，导致一系列严重的生态效应和环境恶化。其中水体富营养化已成为困扰世界各国的主要环境问题之一。许多研究者对富营养化评价进行了研究，并提出了多种富营养化评价模型。其中，海水中氮、磷等营养盐浓度仍是目前海水富营养化最重要的监测和评价指标，对于有害藻华的预警最成功的方法仍在于对可能发生藻华的理化环境的探知，而非对藻华本身的表征。但由于营养盐、cod等参数的测定需要较大型仪器设备且存在分析周期长、工作量大等特点。之后，再带入富营养化评价模型，进行风险估算。从时间、工作量和分析成本上，均不利于水体富营养化的快速监测与评价，更无法及时预警。
趋化是海洋微藻和细菌的主要能动行为，是指细菌和微藻对多种化学物质的浓度梯度所产生的趋向或离避反应。自然海域内理化条件复杂且不均匀，营养物质积累发生时相对浓度仍然很低，扩散距离有限(仅有数厘米)，持续时间很短(10-15min)，为了生存需要，浮游微藻和细菌必须具有极强的识别能力和迅速的移动能力，以便最大限度地暴露于有限的营养资源内。鉴于海洋微藻和细菌对复杂海域环境中的营养物质的仍具有极强的识别能力，趋化感应敏感、迅速。因此，通过检测细菌和微藻趋化行为的发生与否、趋化速度的快慢可以有效表征海水的营养情况，为海域富营养化和赤潮的预估提供科学依据。
对于营养物质的趋化分析，其要点在于水体原位环境精确模拟，稳定、重现性好的营养物质线源和点源梯度形成和微藻趋化行为的实时在线观测的集成。同时，考虑到基于快速检测和应急、预警监测的测试需求，所构建测试系统必须兼具高通量、集成化、价格低廉和适应现场等特征。这些就目前的常规方法而言难以实现。微流控芯片技术的出现为解决上述问题提供了新的契机。微流体的精确控制是微流控芯片的显著特征，化学梯度的精确构建是基于微流体灵活控制是微流控芯片重大优势所在。近年来，研究者已经开发出大能够生成自由流动、形状任意且梯度稳定的梯度生成芯片用来模拟自然环境中化学梯度的时空生成和消散过程。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于微流控趋化芯片的水体富营养化指示方法，具体是利用微流控芯片技术，为微藻和细菌对营养物质的趋化提供友好性测试平台，以精确指示水体营养程度，从生物现象本身，而非理化环境的探知，来进行水体富营养化程度的评价。从而为现有基于理化环境探知的富营养化评价方法提供补充，同时为水体营养情况的快速检测、赤潮、水华预警等方面提供一种快速、便捷、适于现场的方法。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
一种微流控趋化芯片，其特征在于：该芯片有三个单元构成，营养水体梯度形成单元、细胞进样单元和趋化效应观测室；其中，营养水体梯度形成单元，可以形成营养水体线源或点源梯度的一种；细胞进样单元依据梯度形成方式，设在相应位置。
作为优选，所述营养水体线源梯度形成单元，是由上游三叉“ψ”型通道构成，两侧通道与细胞进样口连接构成细胞进样单元，中间通道为营养水体进入通道；三通道流体并流在中轴线形成营养水体线源，流入下游趋化效应观测室，最后连接到废液池。
作为优选，所述营养水体点源梯度形成单元，是由营养水体储液池、进样通道和扩散点构成，储液池连接进样通道，进样通道末端通过扩散点与趋化效应观测室一端中轴线连接；细胞进样单元由细胞储液池和窄细通道构成，通过窄细通道与梯度培养室另一端中轴线连接。
作为优选，整个流路通道高度为50μm，上游“ψ”型通道中两侧通道宽度相等均为300～500μm，长度为1cm；中间通道宽度150～250μm，长度为1cm；两侧通道与中间通道夹角均为45°；趋化效应观测室宽度为2cm，长度4cm。
作为优选，由上下两层组成，上层为液路层，下层为空白层。
作为优选，整个流路通道高度为50μm。营养水体和细胞储液池半径均为1～2mm，深度为2～4mm；进样通道宽度为200～300μm，长度为1cm；细胞进样的窄细通道宽度为50～100μm，长度为1cm；梯度培养观察室宽度为圆形，半径2cm。扩散点为半透膜(包括但不仅限于：聚碳酸酯膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜)或水凝胶(包括但不仅限于，海藻酸钠、聚丙烯酰胺、壳聚糖、胶原、聚乙烯醇)。
作为优选，当扩散点为半透膜时，该芯片由上下两层构成，营养水体进样通道位于芯片下层，通过半透膜与芯片上层趋化效应观测室连接，细胞进样通道也位于芯片上层。
作为优选，当扩散点为水凝胶时，该芯片由上下两层构成，上层为液路层，下层为空白层。水凝胶阻塞于营养水体进样通道末端，将通道与趋化效应观测室连接。
作为优选，其材质可为玻璃、pdms和pmma的一种。采用玻璃化学刻蚀及高温不可逆烧接，pdms软刻蚀及等离子不可逆封接和pmma热压及热压封接技术中的一种构建。
一种基于微流控趋化芯片的水体富营养化指示方法，其特征在于：通过“ψ”通道两个旁支管路向趋化效应检测室输送细胞；中央营养水体进样通道向趋化效应检测室输送含营养物质的溶液。微米尺度下的中央营养物通内流体呈现层流特征(雷诺数re在～0.01)，在趋化效应检测区内形成层流区带。在流体切断后，依靠扩散作用，在趋化通道内自动生成由中央向通道两侧递减的营养物线源浓度梯度，细胞在感应营养物后，由两侧向中间游动，指示水体营养特征。以趋化效应发生用与否指示营养物质的有无。经过饥饿或特殊营养条件诱导(包括但不仅限于以甘氨酸、ala，asp，glu，met，硝酸盐，尿素为唯一氮源)后细胞可对特定营养物质产生趋化，指示营养物质种类。
一种基于微流控趋化芯片的水体富营养化指示方法，其特征在于：营养水体储液池和进样通道中的水体被扩散点(半透膜或水凝胶的一种)与趋化效应观测室阻隔，仅营养物质可通过扩散点扩散到趋化效应观测室，形成营养物质点源扩散梯度。细胞培养室的细胞在感应营养物后，由培养室向营养物质点源移动，指示水体营养特征。以趋化效应持续时间长短指示营养物质浓度高低。经过饥饿或特殊营养条件诱导(包括但不仅限于以甘氨酸、ala，asp，glu，met硝酸盐、尿素为唯一氮源)后细胞可对特定营养物质产生趋化效应，指示营养物质种类。
作为优选，所述趋化效应表征可以采用ccd录像或拍照的方式，从图像上分析藻类趋化密集状态下相对于趋化发生前的灰度或荧光强度的比值。
作为优选，所述细胞为带有鞭毛、能够游动的水生细菌或微藻的一种。
本发明的有益效果是：
(1)微流控趋化芯片可以精确模拟营养水体线源和点源梯度，为微藻和细菌对营养物质的趋化提供友好性测试平台；
(2)从生物现象本身，而非理化环境的探知，来进行水体富营养化程度的评价，更为方便、直观，从而为现有基于理化环境探知的富营养化评价方法提供补充；
(3)该方法具有快速、操作简单、无需大型仪器、适于现场的特点，可为水体营养情况的快速检测、赤潮、水华预警等方面提供方法。
附图说明
图1是能够产生营养物质线源梯度趋化芯片及细胞产生趋化效应示意图；
图2是能够产生营养物质点源梯度趋化芯片及细胞产生趋化效应示意图；
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下面结合附图描述本发明的具体实施例。
如图1、图2所示，
本实施例提供的微流控趋化芯片可以形成营养水体线源梯度。
如图1，图1中所示：1.营养水体梯度形成单元；2.趋化效应观测室；3.细胞进样口；4.细胞进样通道；5.营养水体进样通道；6.废液口。
形成线源营养水体的微流控趋化芯片，是由上游三叉“ψ”型通道和下游的趋化效应观测室构成。上游两侧通道与细胞进样口连接构成细胞进样单元，中间通道为营养水体进入通道。三通道流体并流在中轴线形成营养水体线源，流入下游趋化效应观测室，最后连接到废液池。
形成线源营养水体的微流控趋化芯片，该芯片整个流路通道高度为50μm。上游“ψ”型通道中两侧通道宽度相等均为300～500μm，长度为1cm；中间通道宽度150～250μm，长度为1cm；两侧通道与中间通道夹角均为45°；趋化效应观测室宽度为2cm，长度4cm。
本实施例提供的微流控趋化芯片可以形成营养水体点源梯度。
如图2所示，图中：1.营养水体蓄液池；2.营养水体进样通道；3.趋化效应观测室；4.扩散点；5.细胞进样通道；6.细胞蓄液池。
形成点源营养水体的微流控趋化芯片是由营养水体储液池、进样通道、扩散点、趋化效应观测室和细胞进样单元构成。
形成点源营养水体的微流控趋化芯片，该芯片整个流路通道高度为50μm。营养水体和细胞储液池半径均为1～2mm，深度为2～4mm；进样通道宽度为200～300μm，长度为1cm；细胞进样的窄细通道宽度为50～100μm，长度为1cm；梯度培养观察室宽度为圆形，半径2cm。扩散点为半透膜(包括但不仅限于：聚碳酸酯膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜)或水凝胶(包括但不仅限于，海藻酸钠、聚丙烯酰胺、壳聚糖、胶原、聚乙烯醇)。
实施例1
杜氏盐藻经过饥饿预培养后，以外接微泵通过“ψ”通道两个旁支管路向趋化效应检测室输送，含铵盐(nh4cl)海水以外接微泵通过中央营养水体进样通道向趋化效应检测室输送。微米尺度下的中央营养物通内流体呈现层流特征(雷诺数re在～0.01)，在趋化效应检测区内形成层流区带。在流体切断后，依靠扩散作用，在趋化通道内自动生成由中央向通道两侧递减的营养物线源浓度梯度，杜氏盐藻在感应营养物后，由两侧向中间游动。铵盐浓度为1μm-1ma时，1-2min内产生趋化效应，趋化效应程度为4～4.5。
实施例2
古卡盾藻经过饥饿预培养后，以外接微泵通过“ψ”通道两个旁支管路向趋化效应检测室输送，含铵盐(nh4cl)海水以外接微泵通过中央营养水体进样通道向趋化效应检测室输送。微米尺度下的中央营养物通内流体呈现层流特征(雷诺数re在～0.01)，在趋化效应检测区内形成层流区带。在流体切断后，依靠扩散作用，在趋化通道内自动生成由中央向通道两侧递减的营养物线源浓度梯度，杜氏盐藻在感应营养物后，由两侧向中间游动。铵盐浓度为0.2μm-1ma时，1-2min内产生趋化效应，趋化效应程度为5～6。
实施例3
营养水体储液池和进样通道中的水体被扩散点聚乙烯醇凝胶与趋化效应观测室阻隔，100μm的营养物质可通过扩散点扩散到趋化效应观测室，形成营养物质点源扩散梯度。将经过氨基酸诱导培养的兰隐藻放入细胞培养室，当营养物质为ala，asp，glu，met等氨基酸时，2～3min内产生趋化效应程度为3～4。
实施例4
营养水体储液池和进样通道中的水体被扩散点聚碳酸酯膜与趋化效应观测室阻隔，100μm的营养物质可通过扩散点扩散到趋化效应观测室，形成营养物质点源扩散梯度。将经过氨基酸诱导培养的兰隐藻放入细胞培养室，当营养物质为nh4cl时，不产生趋化效应。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。