分子标志物INHBA和SPP1及其应用的制作方法

本发明涉及胃癌的检测技术领域，尤其是分子标志物inhba和spp1及其应用。

背景技术：

胃癌是中国最常见的恶性肿瘤之一。我国的胃癌具有发病率和病死率高、早期胃癌比例低，进展期及转移性胃癌病例为主等特点。近年来，随着分子生物学技术的高速发展，应用分子标志物来进行肿瘤的筛查、诊断及判断预后已越来越受关注，但目前尚未有有效分子指标可具备高灵敏度及特异性的特点。针对无症状人群及高危人群引入一种无创或微创、客观、高效、特异性及敏感性高的新型检测方法对于提高早期胃癌的诊断率至关重要。同时，术前确定胃癌患者的淋巴结转移状态对术前判断胃癌的分期以及针对性地制定最理想的治疗方案是十分重要的。

胃癌的发病率和死亡率均位居我国恶性肿瘤的第2位，发病人数及死亡人数均占全球胃癌总人数的一半左右。与日韩相比，我国在胃癌早期诊断方面仍存在很大差距。日本癌症研究中心报道早期胃癌所占比例为65.1％，韩国首尔国立癌症中心为40.0％，而中国早期胃癌仅占10％左右，绝大多数患者确诊时已属进展期或晚期。因此我国的胃癌具有发病率和病死率高、早期胃癌比例低，进展期及转移性胃癌病例为主等特点。

目前，胃癌诊断仍以传统的病理形态学观察为基础，主要根据临床表现、体格检查及特殊检查包括胃镜，影像学检查如钡餐、b超、ct、mr、pet/ct，腹腔镜探查和分子诊断等。普通电子内镜是目前诊断胃癌最常用、最有效的方法，电子内镜已广泛应用于国内外临床，它可以直接观察胃内形态变化，了解病变的部位并可以取病变组织活检病理检查确诊胃癌。bustamante等在研究中报道，内镜加活组织检查诊断胃癌的敏感性为82％，特异性为95％。近年来，虽然超声内镜、色素内镜、放大内镜、荧光内镜、红外电子内镜、共聚焦激光显微内镜等检查技术快速发展，在早期胃癌诊断中的价值日益显著，然而广泛应用于临床还需要进一步研究。而伴随着分子病理学应运而生，其通过分子水平来研究和诊断疾病，能更早、更准的诊断癌变风险，为传统病理诊断注入了生机。此外，随着肿瘤分子机制研究的发展，个体化诊疗成为趋势，美国国立综合癌症网络(nccn)每年都会发布恶性肿瘤临床实践指南，明确了分子诊断在肿瘤诊疗中的重要作用，并得到全球临床医师的认可和遵循。

肿瘤淋巴结转移的出现使得胃癌患者无论是在生存时间还是术后复发均处于不利局面。此外，许多学者报道部分根治术后病理证实无淋巴结转移的胃癌患者预后仍不尽人意。淋巴结的微转移是无法采用常规术后he染色确定，故淋巴结转移的准确分期受到一定程度的影响；淋巴结相应周围淋巴管未能清扫完全，导致其内部肿瘤细胞增殖，进一步影响患者预后；跳跃性淋巴结转移的出现，导致清扫范围不足，可能存在残留的转移性淋巴结。由此可见，大力开发胃癌的早期诊断手段具有重要意义，提高胃癌早期诊断率是今后胃癌研究工作的重点。

由于内镜检查前制酸剂的使用、患者就诊时间的延迟、早期胃癌的内镜表现缺乏特征性不典型、内镜医师对早期胃癌在普通内镜下的表现缺乏认识等原因，仍有一部分早期胃癌患者在初次内镜检查的时候被漏诊。加之内镜检查耗时、有创性、价格相对昂贵等原因，限制了其在临床筛查时的广泛应用。此外，部分癌前病变如重度异型性增生和重度肠化生在内镜下较早期胃癌更加难以诊断。目前，很多上皮来源的恶性肿瘤如膀胱癌、宫颈癌、食管癌、口腔癌、大肠癌等的筛查可从复层上皮取样，但由于早期癌症或癌前病变的细胞增生异常在形态学上并非典型，且数目较少，因此，针对早期癌症或癌前病变与良性病变的鉴别诊断传统的细胞染色涂片方法仍有诸多困难，且易漏诊。对于处于早期且不伴随有淋巴结转移的胃癌来说，可以实施侵入性程度较低的治疗方式，而对于不伴有淋巴结转移的进展期局限性胃癌，推荐选择有限淋巴结清扫范围的胃癌根治术来降低术后的死亡率；而对于伴随有淋巴结转移的进展期胃癌来说，根据病人的具体淋巴结转移的具体范围，选择合适的淋巴结清扫范围的胃癌根治术甚至扩大的淋巴结清扫术，可能获得更好的疗效。而有关淋巴结转移的分子标志物目前尚不完全明确，不能较好地满足临床需求。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于胃癌早期诊断和预测淋巴结转移状态的可靠分子标志物，以提高早期胃癌的诊断率和指导临床治疗策略的选择。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，本发明提供一组用于早期胃癌诊断的标志物，由inhba和spp1组成。

优选地，所述胃癌伴随有淋巴结的转移。

作为本发明的第二个方面，本发明提供了上述的标志物在制备早期胃癌诊断试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂盒中含有inhba和spp1的检测试剂；更优选地，所述检测试剂为用于pcr扩增inhba和spp1的mrna或cdna的引物对。其中，引物对的序列如seqidno.7～8和seqidno.9～10所示。

作为本发明的第三个方面，本发明提供一种早期胃癌诊断试剂盒，包括用于pcr扩增inhba和spp1的mrna或cdna的引物对。应当说明的是，试剂盒中包括但不限于所述引物对，还可以是同时对inhba和spp1定性和定量的其它检测试剂。

优选地，所述引物对的碱基序列如seqidno.7～8和seqidno.9～10所示。

作为本发明的第四个方面，本发明提供用于预测胃癌患者淋巴结转移状态的分子标志物，所述分子标志物为inhba和/或spp1。由此，如果待测淋巴结中inhba的含量是正常淋巴结中的4倍以上，则高度怀疑此淋巴结为转移性淋巴结。

作为本发明的第五个方面，本发明提供inhba和/或spp1在制备预测胃癌患者淋巴结转移状态的试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂盒中含有用于pcr扩增inhba和/或spp1的mrna或cdna的引物对。其中，引物对的序列如seqidno.7～8和seqidno.9～10所示。

作为本发明的第六个方面，本发明提供一种预测胃癌患者淋巴结转移状态的试剂盒，所述试剂盒含有用于pcr扩增inhba和/或spp1的mrna或cdna的引物对。优选地，所述引物对的碱基序列如seqidno.7～8和seqidno.9～10所示。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明的分子标志物inhba和spp1可采用半定量荧光实时酶联反应法检测其表达量，相比传统的病理细胞学检测，该分子指标的检测则具有所需样本量小，特异性高、敏感度高、准确性高、可重复性高、自动化等优势；本发明为胃癌早期诊断和预测淋巴结转移奠定了理想的临床应用基础。

附图说明

图1为inhba和spp1在胃肿瘤组织和正常组织中表达的roc曲线；

图2为inhba在胃周淋巴结中表达的roc曲线；

图3为inhba在阴性(正常)淋巴结和阳性(转移性)淋巴结中的表达量；

图4为spp1在阴性(正常)淋巴结和阳性(转移性)淋巴结中的表达量。

具体实施方式

胃癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，发病人数及死亡人数均占全球胃癌总人数的一半左右。中国早期胃癌仅占10％左右，绝大多数患者确诊时已属进展期或晚期。我国的胃癌具有发病率和病死率高、早期胃癌比例低、进展期病例为主要诊治对象等特点。广州市作为中国南方发达地区，拥有国内先进的癌症登记系统。广州市恶性肿瘤死亡第1位是肺癌，其次为肝癌、结直肠癌、胃癌和鼻咽癌，前5位恶性肿瘤死亡占全部恶性肿瘤死亡的66.88％。结合我国和广州市胃癌患者流行病学特点，针对早期胃癌，建立廉价、高效的早诊方法至关重要；同时，针对进展期患者，建立个体化淋巴结清扫方式等对于提高患者诊断准确率进而提高疗效亦显得尤为重要。

目前在全球范围内胃癌的诊断主要根据临床表现、体格检查及特殊检查包括胃镜、影像学检查(如钡餐、b超、ct、mr、pet/ct)、腹腔镜探查和分子诊断等。普通电子胃镜仍是诊断胃癌最常用、最有效的临床方法，它可以直接观察胃内形态变化，了解病变的部位并可以取得病变组织，用于病理检查，确诊胃癌。但是，由于内镜检查前制酸剂的使用、患者就诊时间的延迟、早期胃癌的内镜表现缺乏特征性、内镜医师对早期胃癌在普通内镜下的表现缺乏认识等原因，仍有一部分早期胃癌患者在初次内镜检查的时候被漏诊。此外，部分癌前病变(如重度异型性增生和重度肠化生)在内镜下比早期胃癌更加难以诊断。由此可见，大力开发胃癌的早期诊断手段具有重要意义，提高胃癌早期诊断率是今后胃癌研究工作的重点，而针对无症状人群及高危人群引入一种无创或微创、客观、高效、特异性及敏感性高的新型检测方法对于提高癌前病变、早期胃癌的诊断率至关重要。

近年来，随着分子生物学技术的高速发展，应用分子标志物来进行肿瘤的筛查、诊断及判断预后已越来越受关注。相比而言，分子指标的检测则具有所需样本量小，特异性、敏感度、准确性、可重复性高、自动化等优势。基于上述原因，近年来分子病理学应运而生，其通过分子水平来研究和诊断疾病，能更早、更准的诊断癌变风险，为传统病理诊断注入了生机。但目前尚未有任何胃癌检测的分子指标可具备高灵敏度及特异性的特点。此外，目前无论是胃癌的术中冰冻诊断，还是术后的分期诊断，仍是以传统的病理形态学观察为基础。随着肿瘤分子机制研究的发展，个体化诊疗成为趋势，美国国立综合癌症网络(nccn)每年都会发布恶性肿瘤临床实践指南，明确了分子诊断在肿瘤诊疗中的重要作用，并得到全球临床医师的认可和遵循。

术前确定胃癌患者的淋巴结转移状态对术前判断胃癌的分期以及针对性地制定最理想的治疗方案是十分重要的。对于处于早期且不伴随有淋巴结转移的胃癌来说，可以实施侵入性程度较低的治疗方式，而对于不伴有淋巴结转移的进展期局限性胃癌，推荐选择有限淋巴结清扫范围的胃癌根治术来降低术后的死亡率；而对于伴随有淋巴结转移的进展期胃癌来说，根据病人的具体淋巴结转移的具体范围，选择合适的淋巴结清扫范围的胃癌根治术甚至扩大的淋巴结清扫术，可能获得更好的疗效。因此，找到能够可靠地预测胃癌淋巴结转移状态的分子标志物是亟待解决的问题。

本发明中所发现并首次报道的inhba(抑制素a)和spp1(分泌型磷蛋白1)分子标记物在胃癌肿瘤组织中显著高表达，是胃正常组织中的15倍多，且inhba的敏感性和特异性分别为91.3％和95.7％，roc曲线下面积0.974；spp1的敏感性和特异性分别为82.6％和87.0％，roc曲线下面积为0.924；两者均与肿瘤浸润深度正相关。另一方面，inhba在胃周转移性(阳性)淋巴结中的表达量是胃周非转移性(阴性)淋巴结中的4.1倍(p＜0.001)，其敏感性为80.0％，特异性为81.5％，roc曲线下面积为0.857。inhba和spp1分子标记物因其理想的特异性和敏感性特点，临床应用上可以通过结合胃镜的活检胃组织或者淋巴结，避免了肿瘤细胞百分比低导致漏诊的问题；采用半定量荧光实时酶联反应法检测inhba和spp1的表达量，相比传统的病理细胞学检测，该分子指标的检测则具有所需样本量小，特异性、敏感度、准确性、可重复性高、自动化等优势。本发明为胃癌早期诊断和预测淋巴结转移奠定了理想的临床应用基础。

本发明针对无症状人群及高危人群引入一种无创或微创、客观、高效、特异性及敏感性高的新型检测方法，以提高早期胃癌的诊断率、准确预测淋巴结转移。

本发明基于收集胃癌患者的配对肿瘤组织和正常组织，转移性(阳性)淋巴结和非转移性(阴性)淋巴结样本，采用半定量荧光实时酶联反应法检测多种生物分子靶标的表达情况和差异情况，筛选出肿瘤组织/淋巴结和正常组织/淋巴结中的差异表达的且具有高特异性和灵敏度的分子靶标，以期在胃癌早期筛查及预测淋巴结转移方面的临床应用和推广。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1分子标志物的初步筛选

首先，建立集合患者临床病理资料、多层面生物样本及随访资料完善的胃癌患者数据库，其中，生物样本资源库包括患者的血液样本、肿瘤组织及配对正常组织、转移性(阳性)淋巴结和非转移性(阴性)淋巴结样本。

经过前期的病例筛选：纳入经病理确诊胃腺癌患者，病历资料详尽和手术后病理学资料及随访资料完整者；排除新辅助治疗者；排除行剖腹探查和胃空肠吻合等非肿瘤切除手术患者；排除其他胃恶性肿瘤及胃癌术后复发患者；排除同时或异时性合并其他原发恶性肿瘤患者。

最终纳入并收集分析了66对患者的胃原发肿瘤组织和配对正常组织样本及50例转移性(阳性)淋巴结和54例非转移性(阴性)淋巴结样本。

前期通过对胃癌患者手术切除后的肿瘤标本和正常胃组织标本进行基因芯片和高通量rna测序，采用生物信息学方法比较肿瘤和正常组织中不同基因的表达差异情况，根据软件分析不同基因在肿瘤和正常组织中是否差异表达及差异倍数的不同，结果提示h19(id:283120)，spp1，chi3l1(id:1116)，inhba，krt17(id:3872)，grb7(id:2886)，stip1(id:10963)，col4a2(id:1284)和pcolce(id:5118)这九个候选分子靶标在胃肿瘤组织中的表达显著高于胃正常组织，但是，这些分子标志物在实际组织中的定量表达情况还有待进一步验证。

实施例2分子靶标的表达水平的检测

检测样本：共分析了所收集的66对患者的胃原发肿瘤组织和配对正常组织样本及50例转移性(阳性)淋巴结和54例非转移性(阴性)淋巴结样本。所有标本均在患者行胃癌切除术中肿瘤离体半小时内收集，肿瘤组织取肿物实质区域避开坏死区，正常组织为距离肿物4cm以上的胃粘膜，均切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小留存；胃周淋巴结指区域淋巴结(第1、2站淋巴结)，选取胃周质硬、直径＞1cm的肿大淋巴结和质软、直径＜1cm的非肿大淋巴结，沿长径对半切开，一半送病理科待病理诊断是否为转移性/肺转移性(阳性/阴性)淋巴结，一半留存。所有留存的组织和淋巴结均立即浸泡在rnalater液中4℃过夜，按rna提取试剂盒步骤提取rna。所提取rna均经光谱光度测量仪nanodrop检测，a260/280＞1.8、a260/230接近2.0为质量符合要求。

检测方法：通过半定量荧光实时酶联反应法检测实施例1的九个分子靶标在胃组织和胃周淋巴结样本中的表达情况，并分析其与患者各临床病理特征的相关性和临床应用前景。

逆转录半定量荧光实时酶联反应的具体步骤：所有总rna样本按逆转录试剂盒步骤合成相应cdna，酶联反应(elisa)所使用的不同靶标和内参(actb，即β-actin、β-肌动蛋白)的引物序列如表1所示；

表1引物序列

pcr反应循环程序为：95°，10分钟，溶解温度95°，15秒，延伸温度60°，1分钟，共40个循环。每个循环收集荧光光谱数据以绘制扩增曲线并得出ct值。每个靶标分子标志物的mrna相对表达量代表目标基因相对内参基因的表达水平，由相对表达量＝2^{-(ct目的基因-ct内参基因)}公示算出。

结果与分析：

一、krt17，grb7，stip1，col4a2和pcolcemrna的表达水平在胃肿瘤组织和正常组织中的表达无明显差异，h19和chi3l1仅在部分胃肿瘤组织中高表达。

二、inhbamrna在胃肿瘤组织中的表达量是胃正常组织中的15.4倍(p＜0.001)，其敏感度为91.3％，特异度为95.7％，接收者操作特征曲线(roc曲线)下面积为0.974。spp1mrna在胃肿瘤组织中的表达量是胃正常组织中的15.6倍(p＜0.001)，其敏感度为82.6％，特异度为87.0％，接收者操作特征曲线(roc曲线)下面积auc＝0.924(如图1)。且inhba和spp1的表达量均与肿瘤浸润深度正相关(p＜0.01)。roc曲线是根据真阳性率(灵敏度)为纵坐标和假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。roc曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在auc>0.5的情况下，auc越接近于1，说明诊断效果越好。auc在0.5～0.7时有较低准确性，auc在0.7～0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时有较高准确性。

三、如图3所示，inhbamrna在胃周转移性(阳性)淋巴结中的表达量是胃周非转移性(阴性)淋巴结中的4.1倍(p＜0.001)，其敏感度为80.0％，特异度为81.5％，接收者操作特征曲线(roc曲线)下面积为0.857(如图2)。spp1mrna在胃周转移性(阳性)淋巴结中和胃周非转移性(阴性)淋巴结中的表达量无统计学差异(p＝0.852)(如图4)。目前在临床上暂无成熟的分子标志物用于预测胃癌患者区域淋巴结转移状况，inhba的敏感度、特异度和roc曲线下面积均在80％以上，代表其预测能力的准确性较好，显示了良好的临床应用前景。且inhba的表达量与肿瘤临床分期和病理型肠型正相关(p＜0.001)

综上所述，本实施例的结果显示在胃癌患者的肿瘤组织中inhba和spp1的表达量显著升高，同时在淋巴结中的inhba明显过表达。目前临床上有所应用的辅助诊断胃癌的血清肿瘤标记物为cea、ca72-4、ca19-9，它们的特异度较高可达85.1％–96.2％，但是敏感度仅为20.1–27.6％，严重限制了在临床的应用；而在预测淋巴结转移方面，暂无成熟的靶标使用。

本发明提供的inhba和spp1在保证特异度的基础上，显著提高了检测的敏感度；且首次报道了inhba在预测胃癌淋巴结转移状态方面的良好优势，在灵敏度和敏感度方面均显示了较强的检测能力，预示着良好的临床应用前景。这提示inhba和spp1可作为胃癌早期诊断和预测淋巴结转移的分子靶标。

实施例3试剂盒

本发明的早期胃癌诊断试剂盒的一种实施例，其含有检测inhba和spp1的mrna的引物对，其中引物对的碱基序列如seqidno.7～8和seqidno.9～10所示。

本发明的预测胃癌患者淋巴结转移状态的试剂盒的一种实施例，其含有检测inhba和spp1的mrna的引物对，其中引物对的碱基序列如seqidno.7～8和seqidno.9～10所示。

实施例4试剂盒的应用

本发明提供了一种采用半定量荧光实时酶联反应法检测不同分子靶标在胃癌患者的配对肿瘤组织和正常组织和胃周淋巴结的表达情况，由此用于胃癌的早期筛查及预测淋巴结转移。

例如，采用实施例3的诊断试剂盒检测一个健康人或者某可疑胃癌的筛查者，在其进行胃镜检查的同时，如有发现胃部出现溃疡或者肿物，收集活检的胃部溃疡组织和正常胃组织各1小块，直径约0.1-0.2cm，将组织块直接放置rnalater液中后加入trizol进行匀浆，用于后续提取组织中的rna，具体步骤可根据不同rna提取试剂盒说明书操作。提取到的rna经质检符合要求后采用实施例2的半定量荧光实时酶联反应法(qrt-pcr)分别检测inhba和spp1的表达量。如果在可疑溃疡或肿物组织中，inhba和spp1的表达量是胃正常组织中的10倍以上，则高度怀疑为胃恶性肿瘤，如病理细胞学检测为阴性，建议再次行胃镜多部位取活检行细胞学病理明确。

实施例5试剂盒的应用

例如，对于一位已经确诊胃癌的患者，参照实施例2的实验方法，可以通过收集术前胃镜活检或术中活检胃周淋巴结，采用实施例3的预测胃癌患者淋巴结转移状态的试剂盒检测淋巴结中inhba表达量的情况，如果待测淋巴结中inhba的含量是正常淋巴结中的4倍以上，则高度怀疑此淋巴结为转移性淋巴结。

术前确定胃癌患者的淋巴结转移状态对术前判断胃癌的分期以及针对性地制定最理想的治疗方案是十分重要的。对于处于早期且不伴随有淋巴结转移的胃癌来说，可以实施侵入性程度较低的治疗方式，而对于不伴有淋巴结转移的进展期局限性胃癌，推荐选择有限淋巴结清扫范围的胃癌根治术来降低术后的死亡率；而对于伴随有淋巴结转移的进展期胃癌来说，根据病人的具体淋巴结转移的具体范围，选择合适的淋巴结清扫范围的胃癌根治术甚至扩大的淋巴结清扫术，可能获得更好的疗效。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。