一种培育高饲料利用效率猪的方法与流程

文档序号：15503620发布日期：2018-09-21 22:53阅读：263来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种培育高饲料利用效率猪的方法。

背景技术：

在养猪生产中，饲料投入最大，约占总养殖成本的70％左右，饲料利用效率的微小提升就带来饲养成本的大幅下降。因此，饲料利用效率越来越受到人们的重视，现已成为猪育种中重要选择目标性状之一。饲料利用效率评价指标主要包括饲料增重比、增重饲料比和剩余采食量(residualfeedintake，rfi)。剩余采食量是畜禽实际采食量与用于维持和增重所需要的预测采食量之差，能够反映动物本身由遗传背景决定的代谢差异(fosterw,kilpatrickd,heaneyi.geneticvariationintheefficiencyofenergyutilizationbythefatteningpig.animalscience.1983,37(3)：387-393.)。因此，剩余采食量的值越小代表猪的饲料利用效率越高。当前，剩余采食量已经成为了饲料利用效率的最佳代表性指标。

估计剩余采食量需要大量的平均日采食量数据，虽然电子饲喂设备的更新换代以及采食量测定系统的不断发展使得采食量数据收集更加便利，但是依然昂贵费时。因此，鉴定与剩余采食量相关的分子标记十分必要。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种培育高饲料利用效率猪的方法。

本发明提供的培育高饲料利用效率猪的方法，是检测国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸是a还是g,确定待测猪的基因型是aa还是gg，gg基因型的猪的剩余采食量显著低于aa基因型的猪的剩余采食量；所述aa基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体；所述gg基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体。

所述确定待测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸是a还是g的方法可采用任何现有方法，如测序分析、pcr-sscp、pcr-rflp法等。

所述确定待测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸是a还是g的方法具体可为测序分析。所述测序分析包括pcr扩增和对pcr扩增产物进行测序的步骤；所述pcr扩增所用的引物对满足如下条件:以猪的基因组dna为模板进行pcr扩增的产物含有国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸。

所述pcr扩增所用的引物对具体可为由序列表的序列1所示的单链dna分子和序列表的序列2所示的单链dna分子组成的引物对。当采用所述引物对进行pcr扩增时，根据待测猪的基因组dna的不同，扩增得到的dna片段为序列3所示的核苷酸序列或序列4所示的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种培育高饲料利用效率猪的试剂。

本发明提供的试剂，是检测待测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸是a还是g的物质。

上述试剂中，所述物质为由序列表中序列1所示的单链dna分子和序列表中序列2所示的单链dna分子组成的引物对。

上述试剂在辅助培育高饲料利用效率猪中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂在制备辅助培育高饲料利用效率猪中的应用也是本发明保护的范围。

所述待测猪具体可为杜洛克猪。

国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(a/g)，该单核苷酸多态被命名为g.13.200546552a>g。gg纯合基因型群体比aa纯合基因型群体剩余采食量低约0.1125kg/天，所以该位点可作为猪剩余采食量性状分子育种标记。

本发明的第三个目的是提供一种培育高饲料利用效率猪的方法。

本发明提供的方法，包括选择gg基因型的猪进行育种；所述gg基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体。

本发明的实验证明，本发明使用基因测序方法检测g.13.200546552a>g，只需进行pcr反应，测序即可判别个体的基因型，基因型判型非常准确，检测费用不高，具有很高的育种实践应用价值。用本发明的方法对猪剩余采食量性状进行选择，可使gg基因型猪比aa基因型猪平均剩余采食量降低约0.1125kg/天，从而获得高饲料利用效率猪。应用本发明提供的方法对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效提高实际生产中的猪饲料利用效率。本发明的检测方法操作简单、费用不高、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明将在猪的育种工作中发挥巨大作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

杜洛克猪：该猪购自雏鹰农牧集团股份有限公司。

实施例1、辅助鉴定猪剩余采食量性状

一、猪g.13.200546552a>g多态性位点的确定

1、pcr扩增

根据国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸信息,设计一对引物如下：

u(上游引物)：5’-tcccttggcacaacatggat-3’(序列表的序列1)；

d(下游引物)：5’-ttacaaagagcaggtggaggc-3’(序列表的序列2)。

选择杜洛克猪(2头)为实验材料。以杜洛克猪的基因组dna为模板，使用引物u和d进行pcr扩增。

扩增体系为：基因组dna200ng，10×pcr扩增缓冲液5μl，dntps10mm，上、下游引物各50ng，taqdna聚合酶0.75u，mg²⁺2.5mmol/l，用ddh2o补充反应体系至50μl。

pcr反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

pcr产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存。以2头杜洛克猪的基因组dna为模板进行扩增的产物分别命名为产物1、产物2。

2、克隆测序及序列分析

分别将2种pcr产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收纯化，回收的dna片段连接载体pgem-t(promega公司)后，将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(明日百傲(北京)科技有限公司)，根据载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的t7和sp6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定(英潍捷基(上海)贸易有限公司)。测序结果表明：产物1为序列m1，产物2为序列m2；序列m1和序列m2的长度均为817bp，只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(a/g)，此脱氧核糖核苷酸为国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸，将该单核苷酸多态命名为g.13.200546552a>g。序列m1的核苷酸序列见序列表的序列3(国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸在序列3中对应的是5’末端第617位的a)，序列m2的核苷酸序列见序列表的序列4(国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸在序列4中对应的是5’末端第617位的g)。将国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体基因型命名为aa，国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体基因型为gg，它们的杂合体基因型为ag。

二、国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸多态位点与猪剩余采食量的相关性分析

为确定g.13.200546552a>g多态位点与猪剩余采食量是否相关，以241头杜洛克猪为实验材料，进行如下试验：提取每头猪的基因组dna，用上述引物u和d进行pcr扩增并对每头猪的pcr扩增产物进行测序分析，确定每头猪的基因型是gg还是ag还是aa，方法同步骤一。根据猪的基因型确定猪剩余采食量：gg基因型的待测猪的猪剩余采食量低于aa基因型的待测猪。

利用美国奥斯本自动喂料系统测定241头杜洛克猪的每日采食量和每日体重，90日龄开始测定，体重达100kg时结束，并在此时用aquilavet兽用b超仪测定猪的背膘厚及眼肌面积。试验中剩余采食量(rfi)计算参考前人方法(onterusk,gorbachdm,youngjm,garrickdj,dekkersjcm,rothschildmf.wholegenomeassociationstudiesofresidualfeedintakeandrelatedtraitsinthepig.plosone,2013,8(6):e61756.)，公式如下：

rfi＝adfi-[1×(onbw-30)+b2×(offbw-100)+b3×metamidbw+b4×adga+b5×offbfa]

式中：onbw指初测体重；offbw指结测体重；metamidbw指中间代谢体重，等于[(onbw+offbw)/2]×0.75；adga代表90-180天之间的平均日增重校正值；offbfa指测试结束时10-11肋背膘厚校正到100kg体重时的值。100kg背膘厚和30-100kgadga的校正公式来源于加拿大遗传改良计划。

对g.13.200546552a>g位点与剩余采食量(rfi)以最小二乘法开展关联分析，使用sas9.2软件中的glm程序，配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较rfi在各基因型之间的差异。使用的模型为：

y＝μ+g+s+b+p+e

其中y为性状测定值；μ为群体均值；g为基因型效应；s为性别效应；b为测定批次效应；p为胎次效应；e为随机误差。

结果见表1。

表1猪突变位点g.13.200546552a>g基因型与剩余采食量的关联

注：同列上标不同字母表示差异显著(p<0.05)

结果如表1，表明，gg基因型猪的剩余采食量显著低于aa基因型猪(p<0.05)，ag基因型猪的剩余采食量与gg基因型猪和aa基因型猪无显著差异。说明本发明用国际猪基因组11.1版本参考序列13号染色体上第200546552位脱氧核糖核苷酸多态性鉴定猪剩余采食量方法与猪剩余采食量的实际测定结果一致。

所以，在实际的猪育种中，为获得更低剩余采食量(更高饲料利用效率)的猪，最好选择gg基因型的猪进行育种。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>一种培育高饲料利用效率猪的方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tcccttggcacaacatggat20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ttacaaagagcaggtggaggc21

<210>3

<211>817

<212>dna

<213>猪属猪（susscrofa）

<400>3

ttcatggcagatggtggtcaacttgtctgtgggaggaggtgggatcctgcagaggctgag60

agcagatgctttgtcttctgtgacttttcacctgtctaggtttttattcccccagatgag120

acaatgaatttccttgagggttggaagtatacagtcatacatttcctgtaaaatgcacag180

agaactagaggatcacgcgggaactctggaacctgagaggacttttgggaattaaggatg240

tagtgtaggctagaagtgtacttccttccttggatcttggtttacttaagcacttagtgt300

tcttattgtctaccgtatcatagtttaagtgttcagaatatgttaatatggtatttactg360

gtcatgagttaggaagtacttatcttaccaaaatggcattttaaggacaagctatcatca420

tctaacataatgccaaattgcgatctttccatttctttgtttacgacacaggaaatccgg480

gatcctcttatgcagtggctggggaaacacgtggatcctgaaggagttataacatctagc540

aagctctcccttaaattcgtttcatcctacacatctgaggtggacatcaccccatctgcc600

atacctgtggtgactgacacggcggccttctcctcagaaaattttaactttgagatctac660

cgacagaatttgcagaccaagaaacttggaaaaataattctgtttgccgaagtgacatcc720

accacaatgagtcttctggacgggtgagttctggcccagcaggcttctgtagctgcttgg780

aggaatccaagttaggttgaccgttcccttgaaccag817

<210>4

<211>817

<212>dna

<213>猪属猪（susscrofa）

<400>4