本发明涉及一种产酸性蛋白酶的重组菌及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术：
蛋白酶是能够催化蛋白质水解为小分子的氨基酸和小肽的一类酶的总称，是三大工业用酶之一。根据不同的分类标准，蛋白酶可有多种分类。根据蛋白酶的最适ph可将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。酸性蛋白酶是最适ph范围在2.5–5.0的一类酶，不同微生物的酶略有不同，其活性中心为天冬氨酸。酸性蛋白酶在自然界中来源十分广泛，动植物细胞、霉菌和酵母中都存在酸性蛋白酶。其中微生物酸性蛋白酶具有来源丰富，种类繁多，便于工业生产等诸多优势，因此不仅具有很高的理论研究价值，而且也适合工厂大规模的生产。
酸性蛋白酶的应用十分广泛：食品业中酸性蛋白酶作为凝乳剂应用于奶酪生产中；饮料及酒类生产中，酸性蛋白酶可作为澄清剂降解蛋白类沉淀；在皮革生产中使用酸性蛋白酶进行皮革软化不但可以防止皮革滋生细菌，造成腐败变质，而且可长期保持皮毛的光泽度，防止脱毛，其软化效果远远高于中性蛋白酶和碱性蛋白酶。羊毛业中，酸性蛋白酶作为绿色、无污染的绿色加工制剂，作用条件温和，不会对羊毛的弹性造成破坏，可以提高羊毛的舒适度和柔软度。目前，许多来源于霉菌的酸性蛋白酶已被商业化生产，但适用于不同需求，具有优良性质的酸性蛋白酶仍在不断开发之中。
大豆蛋白和乳蛋白是人们日常生活中常见的优质蛋白，其水解产物相较于未水解蛋白由于包含多种活性多肽更易于被机体吸收，且具有良好的抗氧化活性、降血压、降胆固醇等一系列生物活性功能。因此采用水解工艺，将大豆蛋白和乳蛋白转化为小分子的多肽，提高它们的营养价值和利用效果是一项非常有意义的工作。目前的水解工艺主要为化学水解法和酶解法，由于酶水解法条件温和，副反应少且更加环保，因此更具有研究价值和应用前景。
大肠杆菌生长周期短，生产成本低、可以高密度生长，是工业生产中常用的生产菌株。来源于aspergilluspseudoglaucus的酸性蛋白酶aspergillopepsinⅰ(app)能够有效地水解蛋白底物，但霉菌来源的酸性蛋白酶在大肠杆菌中表达时往往无法表达或表达为没有活性的包涵体，且重组酸性蛋白酶几乎没有用于大豆蛋白和乳蛋白的水解成活性肽研究。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明将app成熟肽基因及app带有前导肽的成熟肽基因分别与带有gst标签(gst标签有助于蛋白可溶性表达)的表达载体pgex-6p-1及pet-28a表达载体进行连接，并在大肠杆菌中进行表达，分析不同表达载体及前导肽对酸性蛋白酶的表达，酶学性质及乳蛋白与大豆蛋白水解，为蛋白酶应用于蛋白水解成活性多肽提供了研究思路和理论基础。
本发明的第一个目的是提供一种产酸性蛋白酶的重组菌，所述酸性蛋白酶是以seqidno.2所示的核苷酸序列作为前导肽进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述的酸性蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌e.colibl21(de3)为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述酸性蛋白酶基因是以pet-28a(+)或pgex-6p-1为载体进行表达。
本发明的第二个目的是提供构建所述重组菌的方法，所述方法包括如下步骤：
pcr扩增获得核苷酸序列为seqidno.2+seqidno.1所示的酸性蛋白酶基因，将所述基因与pet-28a(+)或pgex-6p-1连接并转化到e.colibl21(de3)，获得重组菌。
本发明的第三个目的是提供一种可溶性表达酸性蛋白酶的方法，所述方法是将所述重组菌接种到培养基中，iptg诱导酸性蛋白酶表达。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导的温度为20–30℃，时间为4–12h，诱导剂iptg的终浓度为0.05～0.15mm。
在本实验的一种实施方式中，所述培养基配方为氯化钠1～2％，胰蛋白胨1～2％，酵母提取物0.3～0.8％。
本发明的第四个目的是提供所述重组菌在食品、饲料或化工领域的应用。
有益效果：本发明成功地实现了a.pseudoglaucus来源的酸性蛋白酶的异源表达，并通过添加前导肽和iptg诱导的方法实现了可溶性表达。此外，本发明提供的酸性蛋白酶具有良好的活性和温度稳定性，在20–30℃酶活性保持在80％以上，并具有良好的水解活性，可将大豆蛋白和乳蛋白水解为700–2,500da的活性多肽。
本发明的优点和效果：
本发明成功构建含有目的基因的重组菌株e.colibl21(de3)/pgex-app、e.colibl21(de3)/pgex-proapp、e.colibl21(de3)/pet28-app、e.colibl21(de3)/pet28-proapp、e.colibl21(de3)/pet12-app、e.colibl21(de3)/pet12-proapp。重组菌e.colibl21(de3)/pgex-app、e.colibl21(de3)/pgex-proapp和e.colibl21(de3)/pet28-proapp经诱导表达出酸性蛋白酶app和proapp。粗酶液经his-trap亲和层析柱、gst-t亲和层析柱纯化后得到纯酶app和proapp。酶活测定发现仅proapp表现出酶活。通过优化酶活测定条件，来自e.colibl21(de3)/pgex-proapp和e.colibl21(de3)/pet28-proapp的proapp于分别在ph2.8，55℃和ph3.0，55℃的有最大比酶活达790u·mg-1和903u·mg-1。通过优化蛋白水解活性测定条件，来自e.colibl21(de3)/pet28-proapp的proapp分别在ph3.0和55℃和ph2.2，55℃对大豆蛋白和乳蛋白达到最高水解酶活104u·mg-1和252.2u·mg-1。水解物的分子量在700到2,500da之间，为大豆蛋白和乳蛋白的水解提供了新的研究思路，为酸性蛋白酶的理论研究和工业应用奠定了坚实的研究基础。
具体实施方案
下面是对本发明进行具体描述。
实施例1：酸性蛋白酶的重组菌的构建
一、a.pseudoglaucus酸性蛋白酶基因的获得
(1)菌体培养
马铃薯培养基(g·l-1)：马铃薯200，葡萄糖20，ph7.0，固体培养基添加1.5％琼脂粉。将a.pseudoglaucus菌种分别接种于装有5ml马铃薯液体培养基的试管中，28℃、200r·min-1振荡培养48h。
(2)基因组dna提取
将菌体于10,000r·min-1离心2min并收集细胞，用1ml超纯水离心洗涤2次(10,000r/min，2min)。依次加入0.2ml无菌水、0.3g玻璃珠(0.4mm)和0.3ml的pc(苯酚：氯仿体积比为1：1的混合物)混匀，使用细胞破碎仪破碎细胞30s后加入0.6ml超纯水，颠倒混匀。10,000r·min-1离心10min。取上清300到400μl加入两倍体积冰乙醇，4℃静置4h后10,000r·min-1离心15min。弃上清，真空干燥至无乙醇，加入50μl无菌水溶解基因组。
(3)app和proapp全长基因的获得：
根据a.pseudoglaucus酸性蛋白酶aspergillopepsinⅰ(app)，app的成熟肽基因序列如seqidno.1所示，app自身携带的前导肽序列pro如seqidno.2所示。
合成两端引物(seqidno.3～6)：
app-f：5’-cggaattcatggctgccactggctctgtaactactaatcc(ecori)
app-r：5’-ccgctcgagttaatgatggtggtggtggtgcgcctgcgccgcaaag(xhoi)
proapp-f：5’-cggaattcatggctccaactgctcctcaagttaaagg(ecori)
proapp-r：5’-ccgctcgagttaatgatggtggtggtggtggtgcgcctgcgccgcaaag(xhoi)
采用pcr的方法，进行基因克隆，具体方法如下：
pcr反应体系：ddh2o22μl，premixprimestar25μl，上游引物(20μm)1μl，下游引物(20μm)1μl，基因组dna1μl。
pcr扩增app的条件：98℃预变性30s；98℃10s，68.5℃30s，72℃60s，进行30个循环；72℃延伸10min。以a.pseudoglaucus基因组为模板，以引物app-f和app-r进行pcr反应，获得成熟肽的酸性蛋白酶原全长基因。利用3sspinagarosegeldnapurificationkit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化dna片段。
pcr扩增proapp的条件：98℃预变性30s；98℃10s，68.5℃30s，72℃69s，进行30个循环；72℃延伸10min。以a.pseudoglaucus基因组为模板，以引物proapp-f和proapp-r进行pcr反应，获得前导肽+成熟肽的酸性蛋白酶原全长基因。利用3sspinagarosegeldnapurificationkit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化dna片段。
纯化后的基因pcr产物进行加a处理后与pmd19-t载体通过ta互补连接，
连接产物转化大肠杆菌e.colijm109感受态细胞，重组质粒t-app、t-proapp双酶切、pcr及上海生工测序进行验证。
二、重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pgex-app、e.colibl21(de3)/pgex-proapp、e.colibl21(de3)/pet28-app和e.colibl21(de3)/pet28-proapp的构建。
(1)重组质粒pgex-app、pgex-proapp、pet28-app和pet28-proapp的获得：
t-app、t-proapp、pgex-6p-1及pet-28a的酶切：
利用质粒提取试剂盒mini-plasmidrapidisolationkit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒t-app、t-proapp、pet28-28a和pgex-6p-1。
按照水、缓冲液、质粒dna、酶的顺序加到eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃金属浴1h，在管中加入1/10的loadingbuffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
反应体系组成：10×bufferh4μl，dna10μl，ecori2μl，xhoi2μl，ddh2o将体系补足40μl。
目的基因与质粒pet-28a及pgex-6p-1的连接
反应体系组成如下：质粒与基因按1:7的摩尔比共8μl，t4dnaligase1μl，10×t4dnaligasebuffer1μl，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌e.colijm109
在每管的100μle.colijm109感受态细胞悬液中加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热激90s。快速转移至冰浴中冷却3min。每管中加入700μllb液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清700μl，剩余菌液混匀后将e.colijm109/pgex-app和e.colijm109/pgex-proapp涂布到100μg·ml-1氨苄青霉素的lb平板上，将e.colijm109/pet28-app和e.colijm109/pet28-proapp涂布到50μg·ml-1硫酸卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择：
每个平板分别挑取4个克隆，分别转接入装有5ml的含有相应抗生素的lb培养基中，37℃培养8h，利用质粒提取试剂盒mini-plasmidrapidisolationkit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×bufferh2μl，dna5μl，ecori0.5μl，xhoi0.5μl，ddh2o将体系补足20μl。获得阳性质粒pgex-app、pgex-proapp、pet28-app和pet28-proapp。
按照上述方法获得以pet-12a为表达载体的重组质粒pet12-app、pet12-proapp。
(2)重组质粒转化大肠杆菌e.colibl21(de3)：
在每管100μle.colibl21感受态细胞悬液中加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热激90s。快速转移至冰浴中，冷却3min。每管中加入700μllb液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清700μl，剩余菌液混匀后，将e.colibl21/pgex-app、e.colibl21/pgex-proapp、e.colibl21/pet12-app和e.colibl21/pet12-proapp涂布到含有100μg·ml-1氨苄青霉素的lb平板上，将e.colibl21/pet28-app和e.colibl21/pet28-proapp涂布到含有50μg·ml-1硫酸卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择：
每个平板分别挑取4个克隆，转接入装有5ml的含有相应抗生素的lb培养基中，37℃培养8h，利用质粒提取试剂盒mini-plasmidrapidisolationkit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×bufferh2μl，质粒dna5μl，ecori0.5μl，xhoi0.5μl，ddh2o将体系补足20μl。获得阳性克隆e.colibl21(de3)/pet28-pro1app。验证正确得到的e.colibl21/pgex-app、e.colibl21/pgex-proapp、e.colibl21/pet12-app、e.colibl21/pet12-proapp、e.colibl21/pet28-app和e.colibl21/pet28-proapp。
实施例2：重组菌的诱导表达培养
lb培养基：氯化钠1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，ph7.0。需要时使用前加入硫酸卡那霉素(50μg·ml-1)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取e.colibl21/pgex-app、e.colibl21/pgex-proapp、e.colibl21/pet12-app、e.colibl21/pet12-proapp阳性克隆单菌落接种于10ml含100μg·ml-1氨苄青霉素的lb液体培养基中，挑取e.colibl21/pet28-app和e.colibl21/pet28-proapp阳性克隆单菌落接种于10ml含50μg·ml-1硫酸卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。分别取10ml培养液转接于1l含抗生素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至od600约为1.0。向培养物中加入终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在20℃、25℃和30℃下进行诱导培养12h。
实施例3：重组菌的诱导表达培养
诱导表达：lb培养基组成同实施例2，挑取阳性克隆单菌落接种于10ml含相应抗生素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。保藏甘油菌两支(每支含有1ml菌液，15％的甘油)，同时取1ml培养液转接于50ml含相应抗生素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至od600约为1.0。向培养物中加入终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在20℃、25℃和30℃下进行诱导培养12h。收集菌体，溶解于20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)中，超声破碎20min，工作时间2s，间歇时间3s。将破碎后的菌体12,000rpm，40min。分别取上清和沉淀，sds-page检测蛋白表达。结果显示e.colibl21/pet28-app在三种条件下均不表达，e.colibl21/pet12-app、e.colibl21/pet12-proapp均表达为包涵体，其他三株重组菌能够高效表达。
实施例4：重组蛋白的纯化
lb培养基：氯化钠1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，ph7.0。需要时使用前加入硫酸卡那霉素(50μg·ml-1)或氨苄青霉素(100μg·ml-1)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于10ml含相应抗生素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取10ml培养液转接于1l含相应抗生素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至od600约为1.0。向培养物中加入0.1mm诱导物异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在培养温度30℃下进行诱导培养12h。培养后的重组大肠杆菌细胞6,000rpm离心10min,，用生理盐水洗涤三次后收集。
称取2g湿菌体，加入适量0.1mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液悬浮细胞，于冰浴中进行超声破碎(工作2s，间隔3s，工作时间5min)。4℃条件下12,000rpm离心30min收集上清液作为粗酶液。利用ge公司生产的his-trap亲和层析对粗酶液进行纯化，纯酶液超滤脱盐后用于酶活测定。以pgex-6p-1为表达载体的重组菌株在经his-trap亲和层析纯化后产物需切除gst标签后再经gst-trap亲和层析得到纯酶。
实施例5：比酶活测定
酶活力的测定：根据蛋白酶在一定温度和ph值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度计测定，计算其活力。
表1l-酪氨酸标准曲线绘制：按下表配制l-酪氨酸标准溶液
分别取上述溶液1.00ml，各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0ml，福林试剂1.0ml，置于30℃±0.2℃水浴中显色20min，用分光光度计于波长680nm处以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度a为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线(曲线应通过零点)。
根据作图或回归方程，计算当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光度常数k。
酶活测定的标准条件：取1ml的1％酪蛋白溶液(ph3.0)，加入1ml酶液后于30℃反应10min后加入2ml10％三氯乙酸终止反应。空白样品为1ml酶液中加入2ml10％三氯乙酸于30℃反应10min后加入1％酪蛋白溶液(ph3.0)1ml。将反应液冰浴10min，12,000×g离心15min。取1ml上清，加入5ml的0.4m的碳酸钠溶液混匀后加入1ml福林试剂，摇匀，30℃显色20min，于680nm测吸光度。蛋白质含量测定采用bradford法，以牛血清白蛋白bsa为标准品。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μg的酪氨酸所用的酶量定义为一个单位u。
酶活的计算公式为：酶活(u)＝n×a×k×4/10
比活的计算公式：比活(u·mg-1)＝酶活(u)/蛋白量(mg)
其中，n——稀释倍数；
a——样品平行实验的平均吸光度；
k——吸光常数
4——反应试剂的总体积，ml；
10——反应时间。
结果显示，proapp具有酶活，app不显示酶活。不同温度及ph下计算得到的proapp
的比酶活如表2、表3所示。表2proapp在不同温度下的比酶活
注：测定proapp的最适温度时所用底物均为1％酪蛋白(ph3.0)。
表3proapp在不同ph下的比酶活
注：测定proapp的最适ph时温度均为55℃。
实施例6：温度稳定性测定
分别将来源于e.colibl21/pgex-proapp的proapp和来源于e.colibl21/pet28-proapp的proapp在不同温度下(20―75℃)保温1h后检测剩余酶活，以未经保温处理的酶的酶活为100％。
表4proapp在不同温度下保温1h后的剩余酶活
注：测定proapp的最适水解温度时所用底物均为1％蛋白底物(ph3.0)。
实施例7：大豆蛋白及乳蛋白水解测定
以大豆蛋白和乳蛋白为底物，使用来源于e.colibl21/pet28-proapp的proapp分别测定水解最适温度和最适ph。
表5不同温度下proapp对大豆蛋白和乳蛋白的水解活力
注：测定pro1app的最适水解温度时所用底物均为1％蛋白底物(ph3.0)。
表6不同ph下proapp对大豆蛋白和乳蛋白的水解活力
注：测定proapp的最适水解ph时温度均为55℃。
使用maldi-tof/ms对水解物中的肽段进行分析鉴定，结果如表7所示。
表7大豆蛋白和乳蛋白水解物肽谱序列分析
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种产酸性蛋白酶的重组菌及其应用
<160>27
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>969
<212>dna
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