本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种利用基因工程构建一种高效发酵蔗糖产丁醇的重组拜氏梭菌。
背景技术：
丁醇被认为是最有发展潜力的新型液体燃料之一。随着石油资源的枯竭及原油价格的不断上涨，世界各国对能源安全和资源安全的忧虑日增，所以微生物发酵生产丁醇倍受人们的青睐。
我国目前生产生物丁醇主要以玉米为原料，利用丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)发酵生产丁醇，如华北制药华盈有限公司菌种clostridiumacetobutylicumhy1710、中国科学院上海植物生理研究所选育的clostridiumacetobutylicumea2018菌株、中国科学院微生物研究所选育的clostridiumacetobutylicumsb-1cgmccno.2287菌株。而国外使用的菌种主要是拜氏梭菌，利用糖蜜发酵生产丁醇。拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)是能够发酵产生丁醇的四种梭菌之一，在发酵过程中利用碳源产生丁醇、丙酮、乙醇以及少量的乙酸和丁酸。拜氏梭菌除了能利用葡萄糖外，还能利用木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖醇等多种碳源。
原料转化率低是制约丁醇发酵生产的主要因素之一。为了解决上述问题，各国科研工作者致力于选育能够高效利用生物原料发酵的拜氏梭菌菌种，以提高丁醇的生物发酵效率。然而选育方法具有一定的随机性，筛选得到的拜氏梭菌发酵利用碳源的性能无法确切控制。并且野生资源是有限的，基因工程改造相对于菌种选育具有很大程度的可控性和可操作性，是提高生物丁醇发酵性能的有效方法之一。
技术实现要素：
本发明提供了一种高效发酵蔗糖的重组拜氏梭菌，提高了拜氏梭菌发酵生产丁醇的效率。
本发明还提供了一种提高拜氏梭菌蔗糖发酵性能的方法，极大的促进蔗糖生物质在生物燃料和高附加值化学品生产工业中的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种高效发酵蔗糖的重组拜氏梭菌，所述重组拜氏梭菌中含有蔗糖转运蛋白基因sut1。
优选的，所述蔗糖转运蛋白基因sut1来自马铃薯基因组，其genbank登录号为nm_001318624.1。
优选的，所述重组拜氏梭菌中还含有蔗糖酶基因suc2。
优选的，所述蔗糖酶基因suc2来自酿酒酵母基因组，其genbank登录号为nm_001179510。
优选的，所述重组拜氏梭菌的原始菌株为模式拜氏梭菌菌株或工业拜氏梭菌菌株，或者为经过诱变或遗传改造后的拜氏梭菌菌株。
本发明还提供了一种提高拜氏梭菌蔗糖发酵性能的方法，包括以下步骤：
(1)构建含蔗糖转运蛋白基因sut1的表达载体psos95-stsut1；
(2)构建异源表达sut1基因的重组拜氏梭菌；
(3)所述重组拜氏梭菌在蔗糖为碳源的条件下厌氧发酵，产生生物丁醇。
优选的，所述步骤(1)和步骤(2)替换为：
(1’)构建含蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2的表达载体psos95-stsut1-suc2；
(2’)构建异源表达sut1基因和suc2基因的重组拜氏梭菌。
优选的，所述蔗糖转运蛋白基因sut1来自马铃薯基因组，其genbank登录号为nm_001318624.1。
优选的，所述蔗糖酶基因suc2来自酿酒酵母基因组，其genbank登录号为nm_001179510。
优选的，所述步骤(3)的发酵为将所述重组拜氏梭菌的种子液按照1～6％接种量接种到蔗糖发酵培养液中，在30～37℃下厌氧发酵72～96小时。
现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明构建了一个异源表达蔗糖转运蛋白基因sut1以及蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2的重组拜氏梭菌菌株8052-sut1和8052-sut1-suc2。该重组拜氏梭菌菌株以蔗糖为唯一碳源的培养基中能够快速发酵蔗糖生产生物丁醇。
本发明利用基因工程的方法，在拜氏梭菌中成功的实现了蔗糖转运蛋白sut1和蔗糖酶suc2的异源表达，再利用发酵工程的方法，以蔗糖为唯一碳源的条件下直接发酵蔗糖生产生物丁醇。本发明通过在拜氏梭菌中表达蔗糖转运蛋白sut1，提高拜氏梭菌的蔗糖转运效率；通过表达蔗糖酶基因suc2，使拜氏梭菌更高效的利用蔗糖，从而提高拜氏梭菌的蔗糖发酵性能。
本发明先构建含有蔗糖转运蛋白基因sut1以及蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2的高拷贝表达载体，再构建异源表达该表达载体目的基因的重组拜氏梭菌，通过发酵该重组拜氏梭菌提高拜氏梭菌对蔗糖的高效利用和丁醇的发酵效率。与野生拜氏梭菌菌株发酵蔗糖相比较，本发明构建的重组拜氏梭菌发酵蔗糖的方法极显著的提高了拜氏梭菌蔗糖发酵性能，丁醇产率有了极显著的增加。由此证实利用蔗糖转运蛋白和蔗糖酶基因提高拜氏梭菌蔗糖发酵性能的方法，在工业应用中将具备高效发酵蔗糖生产生物丁醇和稀有生化产品的潜力。
附图说明
图1为本发明实施例1和实施例3构建的表达载体电泳验证，其中，m：λ-hind，1、psos95k，2、psos95-sut1，3、psos95-sut1-suc2；
图2为实施例2和实施例4菌落pcr产物电泳图，其中，m：markerdl5000，1、8052-psos95k扩增出350bp目的大小条带，2、8052-psos95-stsut1扩增出2kb目的大小条带，3、psos95-sut1-suc2扩增出3.5kb目的大小条带；
图3为对照菌与重组菌发酵96h的丁醇产量比较；
图4为工程菌8052-sut1-suc2发酵残糖的hplc图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种高效发酵蔗糖的重组拜氏梭菌，所述拜氏梭菌中含有蔗糖转运蛋白基因sut1。本发明所述蔗糖转运蛋白基因sut1来自马铃薯基因组，其genbank登录号为nm_001318624.1，核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明上述重组拜氏梭菌的构建方法包括：首先构建含蔗糖转运蛋白基因sut1的表达载体psos95-sut1；再将表达载体psos95-sut1与拜氏梭菌重组进行目的基因的异源表达。本发明psos95-sut1表达载体的构建优选包括：利用pcr技术扩增线性化的psos95载体部分和目的基因sut1，采用本领域中的常规技术将上述扩增得到的两种dna片段连接；将连接后的重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中获得阳性转化子，通过基因测序将测序结果完全正确的重组表达质粒命名为psos95-sut1。本发明所述线性化载体步骤及pcr步骤均可采用本领域中的常规操作，本发明对此不做具体限定。
将获得的psos95-sut1进行异源表达。本发明优选将重组表达质粒psos95-sut1进行甲基化，得到甲基化质粒psos95-sut1；再通过电转化法将甲基化质粒psos95-sut1转入拜氏梭菌中，得到阳性转化子。经过菌落pcr验证获得的阳性重组菌株。本发明中，所述重组拜氏梭菌的原始菌株为模式拜氏梭菌菌株或工业拜氏梭菌菌株，或者为经过诱变或遗传改造后的拜氏梭菌菌株，优选使用的拜氏梭菌菌株为c.beijerinckii8052，得到的阳性重组菌株命名为8052-sut1。本发明所述甲基化质粒的步骤及电转化步骤均采用本领域中的常规操作，本发明对此不做限定。
本发明中，所述高效发酵蔗糖的拜氏梭菌中还含有蔗糖酶基因suc2。本发明所述蔗糖酶基因suc2来自酿酒酵母基因组，其genbank登录号为nm_001179510，核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明上述含有蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2的重组拜氏梭菌的构建方法包括：首先构建含蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2表达载体psos95-sut1-sut2；再将表达载体psos95-sut1-sut2与拜氏梭菌重组进行目的基因的异源表达。
本发明优选利用pcr技术扩增线性化的psos95-sut1载体部分和sut2基因，采用本领域中的常规技术将上述扩增得到的两种dna片段连接。其余步骤同8052-sut1的构建，在此不再赘述。本发明构建的含有蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2的重组拜氏梭菌命名为8052-sut1-suc2。
本发明利用基因工程的方法，在拜氏梭菌中成功的实现了蔗糖转运蛋白sut1和蔗糖酶suc2的异源表达。通过在拜氏梭菌中表达蔗糖转运蛋白sut1，提高拜氏梭菌的蔗糖转运效率；通过表达蔗糖酶基因suc2，使拜氏梭菌更高效的利用蔗糖，从而提高拜氏梭菌的蔗糖发酵性能。
本发明还提供了一种提高拜氏梭菌蔗糖发酵性能的方法，将上述技术方案所述重组拜氏梭菌或上述技术方案所述构建方法得到的重组拜氏梭菌在蔗糖为碳源的条件下发酵，产生生物丁醇。
本发明将得到的重组拜氏梭菌在蔗糖为碳源的条件下厌氧发酵，产生生物丁醇，提高生物丁醇的发酵产量。所述发酵包括以下步骤：将重组拜氏梭菌菌株的种子液1～6％接种量，优选为5％的接种量接种到发酵培养液中，发酵温度30～37℃，优选为30℃，发酵时间72～96小时，优选为96小时。本发明所述发酵培养液为蔗糖发酵培养液。
本发明中，所述重组拜氏梭菌的种子液优选为将重组拜氏梭菌菌株先进行平板活化培养，再进行种子液的扩大培养得到。
本发明中，所述重组拜氏梭菌的活化培养包括：将重组拜氏梭菌菌株划线在tya固体平板上培养，培养温度30～37℃，优选为34～35℃；培养时间2～3天，得到活化的重组拜氏梭菌。
本发明中，所述重组拜氏梭菌的种子液扩大培养包括：将活化的重组拜氏梭菌菌株接种到种子培养液中，培养温度30～37℃，优选为35℃，培养时间16～22小时，优选为18～20小时，得到重组拜氏梭菌菌株的种子液；本发明所述种子培养液优选为蔗糖发酵培养液。
与野生拜氏梭菌菌株发酵蔗糖相比较，本发明构建的重组拜氏梭菌发酵蔗糖的方法极显著的提高了拜氏梭菌蔗糖发酵性能。重组拜氏梭菌8052-sut1和8052-sut1-suc2的丁醇产率相较于原始菌c.beijerinckii8052分别提高了7％和18％，有了极显著的增加。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：含蔗糖转运蛋白基因sut1的重组表达质粒psos95-sut1的构建
利用pcr技术扩增线性化的psos95载体部分：
上游引物：5’-taaaaataagagttaccttaaatggtaact-3’，(seqidno.3)；
下游引物：5’-tttaatccctccttttaaattctggatcct-3’，(seqidno.4)。
pcr反应程序为：98℃预变性3min，98℃10s，60℃15s，72℃5min，30个循环，最后72℃延伸10min。
利用pcr技术扩增目的基因sut1：
上游引物:
5’-ccagaatttaaaaggagggattaaaatggagaatggtacaaaaagagaagg-3’，(seqidno.5)；
下游引物：
5’-ccatttaaggtaactcttatttttattatttaatggaaagccccatggcgac-3＇，(seqidno.6)；
下划线斜体部分为与载体同源序列。
pcr反应程序为：98℃预变性3min，98℃10s，58℃15s，72℃2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
最后利用taraka公司的in-fusionhdcloningkit将两个dna片段连接，转化大肠杆菌jm109感受态细胞，在含100mg/ml氨苄青霉素的la抗性平板上筛选获得阳性转化子，再将得到阳性转化子送英俊基因公司测序，最后将测序结果完全正确的重组表达质粒命名为psos95-sut1，电泳图见图1。
实施例2：异源表达sut1基因的重组拜氏梭菌8052-sut1的构建
将含有蔗糖转运蛋白基因的表达质粒psos95-sut1和空载体质粒psos95k分别转入e.colijm109(pan1)中进行甲基化，得到甲基化质粒psos95-sut1和psos95k；通过电转化法分别导入c.beijerinckii8052中，在含50ug/ml红霉素的tya平板上筛选阳性转化子。
培养温度30℃，培养时间2-3天。从选择平板上挑选转化子，经过菌落pcr验证获得阳性重组菌株(上游引物：aggcattagtgcatttaagc(seqidno.7)、下游引物：ccaggctttacactttatgc(seqidno.8)；pcr反应程序为：98℃预变性10min，98℃10s，53℃15s，72℃2min，30个循环，最后72℃延伸10min)，菌落pcr电泳图见图2。
将通过以上方法构建的重组c.beijerinckii8052菌株命名为8052-sut1，空载体对照菌株命名为8052-95k。
实施例3：含蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2的重组表达质粒psos95-sut1-suc2的构建
pcr扩增线性化的psos95-sut载体部分：
上游引物:5'-taaaaataagagttaccttaaatgg-3'，(seqidno.9)；
下游引物:5'-ccctcctttatttaatggaaagccccatggcgactgc-3'，(seqidno.10)。
(引物中下划线斜体部分为sd序列)
pcr反应程序为：98℃预变性3min，98℃10s，57℃15s，72℃6min，30个循环，最后72℃延伸10min，
pcr扩增suc2基因：
上游引物：5'-
ggctttccattaaataaaggagggattaaaatgacaaacgaaactagcgatag-3'，(seqidno.11)；
下游引物：
5'-ccatttaaggtaactcttatttttactattttacttcccttacttgg-3'，(seqidno.12)。
(引物中下划线斜体部分为与载体同源序列。)
pcr反应程序为：98℃预变性3min，98℃10s，57℃15s，72℃2min，30个循环，最后72℃延伸10min。
最后利用taraka公司的in-fusionhdcloningkit将两个dna片段连接，转化大肠杆菌jm109感受态细胞，在含100mg/ml氨苄青霉素的la抗性平板上筛选获得阳性转化子，再将得到阳性转化子送英俊基因公司测序，最后将测序结果完全正确的重组表达质粒命名为psos95-sut1-suc2，电泳图见图1。
实施例4：异源表达sut1基因和蔗糖酶基因suc2的重组拜氏梭菌8052-sut1-suc2的构建
将含有蔗糖转运蛋白基因的重组表达质粒psos95-sut1-suc2转入e.colijm109(pan1)中进行甲基化，得到甲基化质粒psos95-sut1-suc2，通过电转化法导入c.beijerinckii8052中，在含50ug/ml红霉素的tya平板上筛选阳性转化子。
培养温度30℃，培养时间2-3天。从选择平板上挑选转化子，经过菌落pcr验证获得阳性重组菌株(上游引物：aggcattagtgcatttaagc(seqidno.7)、下游引物：ccaggctttacactttatgc(seqidno.8)；pcr反应程序为：98℃预变性10min，98℃10s，53℃15s，72℃4min，30个循环，最后72℃延伸10min)，菌落pcr电泳图见图2。
将通过以上方法构建的重组c.beijerinckii8052菌株命名为8052-sut1-suc2。
实施例5：菌株8052-sut1、8052-sut1-suc2在蔗糖为唯一碳源的条件下蔗糖发酵性能检测
(1)将重组拜氏梭菌菌株8052-sut1、8052-sut1-suc2分别划线于tya固体平板上(tya固体培养基成分：葡萄糖40g/l，蛋白胨6g/l，牛肉膏2g/l，酵母粉2g/l，醋酸铵3g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，k2hpo40.5g/l，feso4·7h2o0.01g/l，琼脂粉15g/l；所述tya固体培养基还含有红霉素50mg/l。ph6.5，115℃高压灭菌15min)，放置于30℃厌氧箱中培养3天，挑选单菌落接种于tya培养基中过夜培养，连续转接活化培养2次。
(2)将上述活化过的菌株8052-sut1、8052-sut1-suc2分别以5％的接种量接种至装有150ml蔗糖发酵培养基的250ml蓝盖瓶中，通氮气10分钟去除瓶内空气，保持厌氧环境，静置于30℃培养箱发酵。定时取样检测。每个实验做3个平行，求取平均值，独立重复3次。
蔗糖发酵培养基成分：蔗糖50g、酵母粉7g、乙酸铵3g、mgso4·7h2o0.4g、k2hpo4·3h2o0.4g、nacl21g、过硫酸铵1g、caco34g，蒸馏水定容至1l，ph值为6.0。蔗糖发酵培养基中还含有25mg/l的红霉素。
利用气相色谱(安捷伦7820)分析检测发酵液中丁醇含量。
气象色谱条件：色谱仪安捷伦7820；检测器：fid检测器，温度300℃；色谱柱型号：zebronzb-wax；前进样口温度：250℃；柱温：80℃保持0.5min，以25℃/min升温至220℃；分流比10：1；氢气流量30ml/min，空气流量300ml/min；载气为氮气，1％的正丙醇作为内标物。
由图3可知，重组菌8052-sut1和8052-sut1-suc2在发酵4天时的丁醇产量比空白对照菌8052-95k分别提高了10.7％、11.8％，由原始菌的6.98g/l分别提高到了7.47g/l、8.25g/l。工程菌8052-sut1-suc2的发酵残糖中无蔗糖，检测到果糖和葡萄糖(图4)，证明了外源蔗糖酶基因的活性表达。
综上所述，通过在拜氏梭菌中异源表达蔗糖转运蛋白基因sut1和蔗糖酶基因suc2的方法，显著提高了拜氏梭菌的蔗糖发酵性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>广西科学院
<120>一种高效发酵蔗糖的重组拜氏梭菌以及提高拜氏梭菌蔗糖发酵性能的方法
<130>gw2018i0425
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1551
<212>dna
<213>solanumtuberosum
<400>1
atggagaatggtacaaaaagagaaggtttagggaaacttacagtttcatcttctctacaa60
gttgaacagcctttagcaccatcaaagctatggaaaattatagttgtagcttccatagct120
gctggtgttcaatttggttgggctcttcagctctctttgcttacaccttatgttcaattg180
ctcggaattcctcataaatttgcctcttttatttggctttgtggaccgatttctggtatg240
attgttcagccagttgtcggctactacagtgataattgctcctcccgtttcggtcgccgc300
cggccattcattgccgccggagctgcacttgttatgattgcggttttcctcatcggattc360
gccgccgaccttggtcacgcctccggtgacactctcggaaaaggatttaagccacgtgcc420
attgccgttttcgtcgtcggcttttggatccttgatgttgctaacaacatgttacagggc480
ccatgcagagcactactggctgatctctccggcggaaaatccggcaggatgagaacagca540
aatgcttttttctcattcttcatggccgtcggaaacattctggggtacgccgccggttca600
tattctcacctctttaaagtattccccttctcaaaaaccaaagcctgcgacatgtactgc660
gcaaatctgaagagttgtttcttcatcgctatattccttttactcagcttaacaaccata720
gccttaaccttagtccgggaaaacgagctcccggagaaagacgagcaagaaatcgacgag780
aaattagccggcgccggaaaatcgaaagtaccgtttttcggtgaaatttttggggctttg840
aaagaattacctcgaccgatgtggattcttctattagtaacctgtttgaactggatcgcg900
tggtttccctttttcttatacgatacagattggatggctaaggaggttttcggtggacaa960
gtcggtgatgcgaggttgtacgatttgggtgtacgcgctggtgcaatgggattactgttg1020
caatctgtggttctagggtttatgtcacttggggttgaattcttagggaagaagattggt1080
ggtgctaagaggttatggggaattttgaactttgttttggctatttgcttggctatgacc1140
attttggtcaccaaaatggccgagaaatctcgccagcacgaccccgccggcacacttatg1200
gggccgacgcctggtgttaaaatcggtgccttgcttctctttgccgcccttggtattcct1260
cttgcggcaacttttagtattccatttgctttggcatctatattttctagtaatcgtggt1320
tcaggacaaggtttgtcactaggagtgctcaatcttgcaattgttgtaccacagatgttg1380
gtgtcactagtaggagggccatgggatgatttgtttggaggaggaaacttgcctggattt1440
gtagttggagcagttgcagctgccgcgagcgctgttttagcactcacaatgttgccatct1500
ccacctgctgatgctaagccagcagtcgccatggggctttccattaaataa1551
<210>2
<211>1599
<212>dna
<213>saccharomycescerevisiae
<400>2
atgcttttgcaagctttccttttccttttggctggttttgcagccaaaatatctgcatca60
atgacaaacgaaactagcgatagacctttggtccacttcacacccaacaagggctggatg120
aatgacccaaatgggttgtggtacgatgaaaaagatgccaaatggcatctgtactttcaa180
tacaacccaaatgacaccgtatggggtacgccattgttttggggccatgctacttccgat240
gatttgactaattgggaagatcaacccattgctatcgctcccaagcgtaacgattcaggt300
gctttctctggctccatggtggttgattacaacaacacgagtgggtttttcaatgatact360
attgatccaagacaaagatgcgttgcgatttggacttataacactcctgaaagtgaagag420
caatacattagctattctcttgatggtggttacacttttactgaataccaaaagaaccct480
gttttagctgccaactccactcaattcagagatccaaaggtgttctggtatgaaccttct540
caaaaatggattatgacggctgccaaatcacaagactacaaaattgaaatttactcctct600
gatgacttgaagtcctggaagctagaatctgcatttgccaatgaaggtttcttaggctac660
caatacgaatgtccaggtttgattgaagtcccaactgagcaagatccttccaaatcttat720
tgggtcatgtttatttctatcaacccaggtgcacctgctggcggttccttcaaccaatat780
tttgttggatccttcaatggtactcattttgaagcgtttgacaatcaatctagagtggta840
gattttggtaaggactactatgccttgcaaactttcttcaacactgacccaacctacggt900
tcagcattaggtattgcctgggcttcaaactgggagtacagtgcctttgtcccaactaac960
ccatggagatcatccatgtctttggtccgcaagttttctttgaacactgaatatcaagct1020
aatccagagactgaattgatcaatttgaaagccgaaccaatattgaacattagtaatgct1080
ggtccctggtctcgttttgctactaacacaactctaactaaggccaattcttacaatgtc1140
gatttgagcaactcgactggtaccctagagtttgagttggtttacgctgttaacaccaca1200
caaaccatatccaaatccgtctttgccgacttatcactttggttcaagggtttagaagat1260
cctgaagaatatttgagaatgggttttgaagtcagtgcttcttccttctttttggaccgt1320
ggtaactctaaggtcaagtttgtcaaggagaacccatatttcacaaacagaatgtctgtc1380
aacaaccaaccattcaagtctgagaacgacctaagttactataaagtgtacggcctactg1440
gatcaaaacatcttggaattgtacttcaacgatggagatgtggtttctacaaatacctac1500
ttcatgaccaccggtaacgctctaggatctgtgaacatgaccactggtgtcgataatttg1560
ttctacattgacaagttccaagtaagggaagtaaaatag1599
<210>3
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
taaaaataagagttaccttaaatggtaact30
<210>4
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tttaatccctccttttaaattctggatcct30
<210>5
<211>51
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ccagaatttaaaaggagggattaaaatggagaatggtacaaaaagagaagg51
<210>6
<211>52
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ccatttaaggtaactcttatttttattatttaatggaaagccccatggcgac52
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
aggcattagtgcatttaagc20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
ccaggctttacactttatgc20
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
taaaaataagagttaccttaaatgg25
<210>10
<211>37
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
ccctcctttatttaatggaaagccccatggcgactgc37
<210>11
<211>53
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
ggctttccattaaataaaggagggattaaaatgacaaacgaaactagcgatag53
<210>12
<211>47
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
ccatttaaggtaactcttatttttactattttacttcccttacttgg47