革兰氏阳性菌的灭活的制作方法

专利名称：革兰氏阳性菌的灭活的制作方法
专利说明革兰氏阳性菌的灭活 本发明涉及用于在医学上灭活重要的革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和甲氧西林(多)-耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，凝固酶阴性凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococcus)(CONS)，链球菌属(Streptococcus)，肠球菌属(Enterococcus)和梭菌属(Clostridium)菌种的方法。

背景技术：
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)正逐渐成为日益成问题的微生物，其感染率不断上升且有效的控制方法越来越受到限制。除MRSA对抗生素的抗性外，由于很少有效的灭菌方法可用于环境净化；例如在空气中和接触表面上，所以存在显著的问题。公众和媒体对MRSA的传播和控制中的兴趣日益升高，并且它成为卫生保健行业中最重大的问题之一。医院和疗养院是最严重影响的地方。此外，群体获得的MRSA现在也公认为是日益增加的问题，其传播发生在公共和社会场所，如公共体育馆和运动场。
除MRSA外，已知其它革兰氏阳性菌导致健康问题，特别是在医院环境中。例如，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，其为一种凝固酶-阴性葡萄球菌(CONS)，可以引起感染，特别是在婴儿中和在接受了修复移植手术的住院患者中。酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)是一种革兰氏阳性球菌，其通常与感染，如咽炎、脓皮病、猩红热、丹毒、蜂窝织炎、葡萄球菌中毒性休克综合征、风湿热、肾小球肾炎、菌血症(bacteraemia)和坏死性筋膜炎相关，其通常称为“食肉细菌”。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(另一种革兰氏阳性球菌)是尿道和伤口感染，以及其它感染，包括严重患病的住院患者中的菌血症、心内膜炎和脑膜炎的普遍原因。多抗生素耐药性也成为被文件充分证明的与肠球菌感染有关的问题。梭菌菌种，特别是艰难梭菌(C.difficile)，已经与老年患者的高死亡率联系起来了，其原因在于与腹泻有关的脱水，在医学上称为抗生素相关性假膜结肠炎。
已经提出了许多用于消灭有害细菌，如MRSA的技术。例如，US6,251,127描述了利用亚甲基蓝或甲苯胺蓝(toluidene blue)灭活细菌和真菌伤口感染的光力学方法。将与光敏剂组合的光能用于治疗或检测活组织的病理学，所述活组织包括癌症和微生物病原体。所使用的光具有在约450nm到约850nm范围内的波长。检测证明了与光敏剂组合的光处理对于破坏体内感染伤口内的金黄色葡萄球菌；以及对于体外破坏抗生素耐药性葡萄球菌、链球菌、肠球菌、大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌(Pseudomonas)、流感嗜血菌(Haemophilus influenza)和白色念珠菌(Candida albicans)的功效。另外，提供了在多种浓度的上述细菌和假丝酵母(Candida)的存在下亚甲基蓝和甲苯胺蓝活化的波长范围。
同时在一些环境中，US 6,251,127的方法学可以是有效的，然而它具有显著的实践缺点，该缺点是必须对待灭活细菌施用光敏剂。US2005/0049228提出了相似的问题，其也需要光敏剂和光的组合使用；在这种情形中，波长在500nm到580nm的范围内。对光敏剂的需要是这些技术的显著限制。
本发明的目的是提供一种用于灭活选定的细菌，特别是MRSA，以及更一般地，葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和梭菌属菌种的简单有效技术。
发明概述 一种用于灭活一种或多种致病性革兰氏阳性菌的方法，其包括在不使用光敏剂的条件下将细菌暴露于可见光。
优选地，所述细菌选自葡萄球菌属，特别地是MRSA，CONS，链球菌属，肠球菌属和梭菌属菌种。
应该理解，术语致病性是用于能够在人类或动物受试者中引起疾病或感染的革兰氏阳性菌菌种和/或菌株的情形中。还应该理解，一些细菌常常是共生的，因为它们能够群集和/或生活在健康宿主上/中，并且，除非或直到宿主由于一些其它形式的疾病或伤害，如创伤而成为无免疫应答的和/或不健康的时，它们才成为致病性的。这样“潜在地”致病性细菌也包括在本发明内。
而且，应该理解，术语灭活意指将所述细菌杀死，或损伤以减少或抑制细菌的复制。因此可以认为本文教导的方法和系统是杀菌的和/或抑制细菌的，并且其可能取决于细菌的菌种/菌株，光的波长，剂量，等。
已发现将这些细菌暴露于蓝光，或含有蓝光的白光，会刺激灭活过程。利用处于可见波长范围内的光的优点是对人或动物健康不存在有害影响。因此，本发明可以用于广泛范围的应用，如空气消毒，接触表面和材料消毒，以及最值得注目地，伤口保护和组织消毒。
按照本发明的另一个方面，提供了用于灭活致病性革兰氏阳性菌的方法，所述致病性革兰氏阳性菌包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)、链球菌、肠球菌和梭菌菌种中的至少一种，所述方法包括将细菌暴露于具有在400-500nm范围内波长的可见光。所述可见光可以具有在400-450nm范围内的波长。所述光可以具有在400-420nm范围内的波长。所述光可以具有405nm的波长。
按照本发明的又一个方面，提供了用于灭活致病性革兰氏阳性菌的系统，所述致病性革兰氏阳性菌包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)、链球菌、肠球菌和梭菌菌种中的至少一种，所述系统包括用于将它们暴露于具有在400-500nm范围内波长的可见光的装置(means)。所用的光的波长优选地在400-500nm的范围内。所述波长可以在400-450nm的范围内，且更特殊地，在400-420nm的范围内，其在405nm具有最佳灭活性。
按照本发明的再一个方面，提供了可见光对于灭活致病性革兰氏阳性菌的应用，所述可见光具有在400-500nm范围内，特别地在400-420nm内的波长，所述致病性革兰氏阳性菌包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)、链球菌、肠球菌和梭菌菌种中的至少一种。
附图简述 现在将仅通过实例方式并且参考附图描述本发明的不同方面，其中

图1显示滨松氙灯(Hamamatsu Xenon lamp)完整发射光谱； 图2更详细显示图1中氙灯的紫外发射光谱； 图3是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌菌株的细菌计数与暴露于波长大于400nm的光的时间的函数图； 图4是第二种甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌菌株的细菌计数与暴露于波长大于400nm的光的时间的函数图； 图5是金黄色葡萄球菌NCTC 4135的细菌计数与暴露于波长大于400nm的光的时间的函数图； 图6是表皮葡萄球菌NCTC 7944的细菌计数与暴露于波长大于400nm的光的时间的函数图； 图7是酿脓链球菌NCTC 8198的细菌计数与暴露于波长大于400nm的光的时间的函数图； 图8是粪肠球菌的细菌计数与暴露于波长大于400nm的光的时间的函数图； 图9是金黄色葡萄球菌NCTC 4135混悬液中的细菌计数与暴露于不同波长范围的光的时间的函数图； 图10是对于金黄色葡萄球菌NCTC 4135，细菌的对数减少与波长(400-500nm)的函数图； 图11是对于不同光强度，金黄色葡萄球菌NCTC 4135混悬液中的细菌计数与暴露于波长大于400nm的光的时间的函数图； 图12是金黄色葡萄球菌NCTC 4135通过暴露于波长大于400nm的光的表面灭活的直观指征。通过对在暴露于该光的区域上的金黄色葡萄球菌生长的抑制证明了表面灭活； 图13是金黄色葡萄球菌NCTC 4135的细菌计数与暴露于405nm的光的时间的函数图； 图14是甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌菌株的细菌计数与暴露于405nm的光的时间的函数图； 图15是酿脓链球菌NCTC 8198的细菌计数与暴露于405nm的光的时间的函数图；和 图16是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)13124的细菌计数与暴露于405nm的光的时间的函数图。
附图详述 已经发现将MRSA暴露于蓝光会导致显著的灭活作用。这种狭窄范围的波长是白光光谱的一部分。对于全部白光光源，仅有一小部分光输出处于这一范围内，典型地，1％或2％。因此，为了提供充足量的光并证明该技术的效力，所使用的光源是氙灯(Hamamatsu Photonics UK Limited(滨松光子学英国有限公司))，该灯的发射光谱显示在图1和2中。该灯与光学纤维光导和光学纤维的选择组合使用，以允许将金黄色葡萄球菌混悬液暴露于指定波长的可见光。在所有实验中，将光导的输出维持在距样品5cm的距离处。
为了证明所述技术的效力，已经进行了许多研究。所使用的细菌如下金黄色葡萄球菌NCTC 4135；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌LMG15975；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌16a(临床分离株)，表皮葡萄球菌NCTC 7944，酿脓链球菌NCTC 8198，粪肠球菌和产气荚膜梭菌13124。使用磷酸缓冲盐(PBS)，将每份样品连续稀释到适当的浓度，使用营养琼脂(NA)进行涂布，并且然后在37℃培养24小时。
制备甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌LMG 15975和临床分离株16a的混悬液，并将其暴露于可见光。所述光在作用于所述细菌混悬液之前，通过400nm长波滤过器(400nm是50％传播的截止点)传播。这仅容许400nm和以上的波长(可见光)照射样品。这些实验的结果显示在图3和4。从这些可以看出光处理导致培养收集物MRSA(LMG 15975)和高抗性临床分离株(16a)计数的显著减少。对照数据指在相同时间间隔中未处理的样品。
将金黄色葡萄球菌NCTC 4135的混悬液也暴露于可见光处理。再一次，光柱在作用于细菌混悬液之前，通过400nm长波滤过器传播，这仅容许400nm和以上的波长传播。从图5可以看出，即使具有大约107菌落形成单位/毫升(cfu/ml)的高起始细菌菌群，氙光源导致金黄色葡萄球菌计数的显著减少。应用表皮葡萄球菌NCTC 7944，酿脓链球菌NCTC 8198和粪肠球菌进行了相似的实验。细菌菌群中的相关减少显示在图6，7和8中。在这些中的每一个中，均观察到细菌计数的显著减少。
进行了利用一系列滤光器的曝光检测。将细菌混悬液暴露于下列波长范围长达90分钟的时间大于550nm(使用550nm的长波滤过器)；大于500nm(使用500nm的长波滤过器)；低于500nm(使用500nm的短波滤过器)；400-500nm(组合使用400nm的长波滤过器和500nm的短波滤过器)；450-500nm(组合使用450nm的长波滤过器和500nm的短波滤过器)；大于450nm(使用450nm的长波滤过器)，和大于400nm(使用400nm的长波滤过器)。图9中由此生成的灭活曲线仅容许进行定性的比较，其原因在于滤过器没有明确的截止波长，并且传到混悬液的光强度对于不同的曲线而不同。然而，该结果确实表明，400nm和500nm之间的波长范围的确提供金黄色葡萄球菌的高灭活率。
还使用每个具有10nm FWHM(全宽，半最大值)的带通滤过器进行了实验。将甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌LMG 15975的混悬液(大约105cfu/ml菌群)暴露于通过下列带通滤过器传播的可见光400nm，405nm，410nm，415nm，420nm，430nm，440nm，和450nm。对于每个滤光器改变灯的强度，从而确保混悬液处的光能对每次测量都相同，由此容许结果的直接比较。这些试验的结果表明，使用400nm，405nm和415nm带通滤过器曝光过的样品具有减少的菌落形成单位计数/ml；即，处于这些狭窄带宽中波长的光对金黄色葡萄球菌菌株具有灭活作用。
使用金黄色葡萄球菌NCTC 4135的混悬液进行更加详细的波长灵敏性分析，并且将其显示在图10中。该结果表明，使用400nm，405nm，410nm，415nm和420nm带通滤光器曝光过的样品具有减少的菌落形成单位计数/ml；即，处于这些狭窄带宽内波长的光对金黄色葡萄球菌菌株具有灭活作用。从这些结果，可以推论波长范围400-450nm的可见光曝光是葡萄球菌灭活作用的主要诱导因素，其在400-420nm范围内有增强的灭活作用发生，且最佳灭活作用发生在405nm处。而且，已经观察到在所述波长处需要较低的剂量，并且典型地，所述剂量小于200J/cm2，如小于100J/cm2。
在另一个实验中，将金黄色葡萄球菌NCTC 4135混悬液暴露于不同强度的可见光处理中。使用400nm的长波滤过器，即，对大于400nm的波长进行这些测量。图11显示这些实验的结果。可以看出随着光强度的降低，灭活率也降低。确定了使用不同滤光器和光强度对葡萄球菌、链球菌和肠球菌菌种完全灭活所需的特定剂量。样品结果显示在下表中 还检验了可见光曝光对表面净化的作用。这是通过在培养前将涂布在营养琼脂上的金黄色葡萄球菌细胞暴露于光处理中(通过400nm的长波滤过器)进行的。结果的实例显示为图12中培养板上生长抑制的区域。
使用405nm LED阵列作为光源装配了与使用氙灯的系统相似的处理系统。使用金黄色葡萄球菌NCTC 4135，MRSA 16a，酿脓链球菌NCTC8198和产气荚膜梭菌13124进行实验。细菌菌群中相关的减少分别显示在图13，14，15和16中。确定了使用405nm LED阵列对葡萄球菌、链球菌和梭菌菌种完全灭活所需的特定剂量。样品结果显示在下表中 使用来自氙灯的大于400nm波长的光和405nm LED阵列对细菌灭活所需剂量(5-对数减少)的比较显示在下表中
已经证明400-500nm，特别是400-450nm波长的可见光(蓝光)的使用是葡萄球菌菌株，包括MRSA，以及CONS，链球菌，肠球菌和梭菌的有效灭活方法，其在400-420nm范围内，且特别地在约405nm处，具有增强的抑制。这说明具有这些范围内波长的输出的光源可以潜在地用于临床环境中，以减少存在于空气中和接触表面和材料上的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌，以及其它医学上重要的革兰氏阳性菌种的水平，并且，最重要地，可以用于伤口保护和组织处理。所需要的精确参数应该取决于细菌菌株，所使用的光的波长以及光的强度。这些可以容易地通过实验确定。
对所公开安排的改变在不偏离本发明的条件下是可能的。例如，尽管具有多种不同滤光器的氙灯和405nm LED阵列都被用作灭活光源，但是应该理解可以使用任何合适的光源。同等地，尽管在此描述了特殊的实验安排，但是应该显而易见地是所使用的光源可以包含在，例如手持装置中，或被设计为在必须保持无MRSA的区域中或周围操作。因此，以上特定实施方案的描述仅是通过实例完成的，且不是为了限制的目的。显然地，在不显著改变所述操作的条件下可以进行细微的修改。
权利要求
1.一种用于灭活一种或多种致病性革兰氏阳性菌的方法，其包括在不使用光敏剂的条件下将所述细菌暴露于可见光。
2.按照权利要求1的方法，其中所述细菌选自由下列各项组成的组甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)，链球菌属(Streptococcus)，肠球菌属(Enterococcus)和梭菌属(Clostridium)菌种。
3.权利要求1或2中所述的方法，其中所述可见光具有400-500nm范围内的波长。
4.权利要求3中所述的方法，其中所述可见光具有400-450nm范围内的波长。
5.权利要求4中所述的方法，其中所述光具有400-420nm范围内的波长。
6.权利要求5中所述的方法，其中所述光在波长405nm区域内。
7.一种用于灭活一种或多种致病性革兰氏阳性菌的方法，其包括将所述细菌暴露于具有在400-500nm范围内波长的可见光。
8.按照权利要求7的方法，其中所述细菌选自由下列各项组成的组甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)，链球菌属，肠球菌属和梭菌属菌种。
9.权利要求7或8中所述的方法，其中所述可见光具有400-450nm范围内的波长。
10.权利要求9中所述的方法，其中所述光具有400-420nm范围内的波长。
11.权利要求10中所述的方法，其中所述光在波长405nm区域内。
12.一种用于灭活一种或多种致病性革兰氏阳性菌的系统，其包括用于将所述细菌暴露于具有在400-500nm范围内波长的可见光的装置(means)。
13.按照权利要求12的方法，其中所述细菌选自由下列各项组成的组甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)，链球菌属，肠球菌属和梭菌属菌种。
14.具有在400-500nm范围内波长的可见光对于灭活一种或多种致病性革兰氏阳性菌的应用。
15.按照权利要求14的方法，其中所述细菌选自由下列各项组成的组甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)，链球菌属，肠球菌属和梭菌属菌种。
全文摘要
用于灭活医学上重要的革兰氏阳性菌，包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)，链球菌属，肠球菌属和梭菌属菌种的方法，所述方法包括暴露于可见光，且特别地在波长400-500nm范围内的光。
文档编号A61N5/06GK101272822SQ200680035823
公开日2008年9月24日 申请日期2006年7月28日 优先权日2005年7月29日
发明者约翰·加洛韦·安德森, 米歇尔·麦克莱恩, 格拉尔德·亚历山大·伍尔西, 斯科特·约翰·麦格雷戈 申请人:斯特拉斯克莱德大学