一种链双1,2,3-三唑罗丹明6G类荧光探针及其制备与应用的制作方法

本发明涉及一种链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针及其制备与应用。

(二)

背景技术：

罗丹明(rhodamine)是一种邻苯二酚类荧光染料，从结构上来说它具有一个氧杂蒽环，分子具有刚性平面，稳定性好，且具有多个可修饰位点，受样品干扰性小；它荧光的最大发射位于500-700nm处即红色可见光区域，其摩尔吸光系数大，量子产率高。正是由于罗丹明优越的光物理性和光稳定性，它在激光染料、荧光标尺、染色剂；纳米聚合物的表面修饰、微粒的结构和动态研究、单分子成像和生物成像等方面应用相当广泛。

铁作为人体含量的必需微量元素，存在于多种蛋白质和酶中，是血红蛋白、血红素、许多酶和免疫系统化合物等的重要组成成分；参与氧的运输和储存，并直接参与能量的释放；促进人体发育；增加对疾病的抵抗力；调节组织呼吸，防止疲劳。铁离子本身其实并不具有毒性，但如果摄入或误服过量的含铁物质时也可能导致铁中毒。而随着社会工业进展的加剧，环境中存在的铁离子含量随之增加，并通过各种途径进入人体，危害人类健康。因此，设计合成检测三价铁离子的探针具有重要的应用价值。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种式(ⅳ)所示的链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针及其制备与应用，通过click反应将叠氮烷烃与罗丹明6g进行成环偶联，烷烃链为linker将罗丹明6g连接在两端，合成了链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针，并利用本探针分子独特的“开-关”机理，识别并检测fe³⁺。该方法合成路线短，简单易操作，并且对fe³⁺的识别效果好，可以非常有效地检测出环境水样中fe³⁺的含量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种式(ⅳ)所示链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针，

式(ⅳ)中，r为下列之一：ch2、ch2ch2、ch2ch2ch2ch2、ch2ch2ch2ch2ch2、ch2ch2ch2ch2ch2ch2、ch2ch2och2ch2。

本发明提供一种所述链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针的制备方法，所述方法为：以式(ii)所示化合物和式(iii)所示化合物为原料，以cu⁺作为催化剂，在四氢呋喃中，40-60℃反应完全后，将反应液分离纯化，获得式(ⅳ)所示链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针；

式(iii)中，r为下列之一：ch2、ch2ch2、ch2ch2ch2ch2、ch2ch2ch2ch2ch2、ch2ch2ch2ch2ch2ch2、ch2ch2och2ch2。

进一步，所述式(ii)所示化合物与式(iii)所示化合物投料物质的量之比为2.2:1，所述催化剂用量以cu物质的量计，所述cu与式(iii)所示化合物物质的量之比为1.2：1；所述四氢呋喃体积用量以式(iii)所示化合物物质的量计为44ml/mmol。

进一步，反应液分离纯化的方法：反应完全后，将反应液浓缩至干，然后加入水溶解，二氯甲烷进行萃取(3×50ml)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析(ch3oh:ch2cl2＝1:20，v/v为展开剂)，收集rf值0.4-0.5的组分，获得式(ⅳ)所示链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针。

进一步，所述式(ii)所示化合物按如下方法制备：以式(i)所示的化合物与炔丙胺为原料，在甲醇中，回流反应完全，反应液后处理，获得式(ii)所示化合物；式(i)所示化合物与炔丙胺投料物质的量之比为1:5；甲醇体积用量以式(i)所示化合物物质的量计为20ml/mmol；

进一步，反应液后处理方法为：反应完全后，将反应液浓缩至干，然后加入水溶解，二氯甲烷进行萃取(3×50ml)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂后进行薄层层析(ch3oh:ch2cl2＝1:20，v/v为展开剂)，收集rf值0.4-0.5的组分，获得式(ii)所示化合物。

本发明还提供一种所述链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针在检测fe³⁺中的应用，该类荧光探针可以可视化检测环境水样中fe³⁺。

一方面，本发明所述探针可以定性检测fe³⁺，所述的应用为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mm的pbs缓冲液中，再加入5μmol/ml链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针乙腈溶液，若有颜色产生(通常室温下5-50min内即可产生颜色变化)，则待测样品含有fe³⁺。

另一方面，本发明所述探针可以定量检测fe³⁺，所述的应用为：将待测样品加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mm的pbs缓冲液中，再加入5μmol/ml链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针乙腈溶液后，在555nm处测定荧光值，根据fe³⁺标准曲线，获得待测样品中fe³⁺浓度；所述待测样品与pbs缓冲液体积比为1:1，所述待测样品与探针乙腈溶液体积比为10:1；所述fe³⁺标准曲线是在相同条件下以fe³⁺水溶液浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标制成。

进一步，所述fe³⁺标准曲线按如下方法制备：将浓度梯度为0，0.01，0.05，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5μmol/ml的fe³⁺水溶液分别加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mm的pbs缓冲液中，再加入5μmol/ml链双1,2,3-三唑罗丹明6g类荧光探针乙腈溶液后，在555nm处测定荧光值，以fe³⁺浓度为横坐标，以荧光值为纵坐标，获得fe³⁺标准曲线；所述fe³⁺水溶液与pbs缓冲液体积比为1:1，所述fe³⁺水溶液与探针乙腈溶液体积比为10:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明成功的设计并合成了一种新型的式(ⅳ)所示的链双1,2,3-三唑罗丹明6g类探针；(2)本发明合成的探针对fe³⁺具有高效专一的选择性，可通过颜色变化和荧光变化来识别fe³⁺。(3)本发明通过链双1,2,3-三唑罗丹明6g类衍生物探针对金属离子的识别能力、以及该类探针不同链长对探针识别fe³⁺的能力是否有影响等方面进行了实验比较，分析其构效关系，发现五碳链的烷烃链可以提供三价铁离子与探针络合的最佳空间位置，且烷烃链中若有氧离子存在会影响效果。(4)本发明合成的探针可以应用于环境水样中的fe³⁺的检测。(5)本发明探针方法测定三价铁离子浓度具有误差小、灵敏度高、准确度高等特点，尤其在检测低浓度的三价铁离子中，更显示出优越的灵敏度和准确度。本发明设计合成的探针的特色之处在于合成路线短，简单易操作，并且对fe³⁺的识别效果理想，将其定性应用于环境水样中初步fe³⁺的检测，也可以定量来测定水样中的fe³⁺。将来可将其进一步应用于环境和生物系统中对fe³⁺的检测。

(四)附图说明

图1是本发明实施例9中的荧光探针化合物ⅳ-4与fe³⁺作用前后溶液颜色变化(a：荧光下；b：肉眼可见，其中左侧均为荧光探针化合物ⅳ-4溶液颜色变化，右侧均为化合物ⅳ-4与fe³⁺作用后溶液颜色变化)。

图2是本发明实施例9中的荧光探针化合物ⅳ-4对各金属离子的紫外吸收谱图，a为紫外-可见吸收光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收值od值。b为各金属离子555nm处紫外吸收值柱形图。

图3是本发明实施例9中的荧光探针化合物ⅳ-4对各金属离子的荧光强度谱图。a为荧光强度谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。b为各金属离子荧光强度柱形图。

图4是本发明的荧光探针化合物ⅳ-4的荧光强度以及ⅳ-4+fe³⁺离子络合物的荧光强度分别随ph变化的荧光发射图(555nm)。横坐标为ph，纵坐标为荧光强度。

图5是本发明实施例8中的荧光探针化合物ⅳ1-6对fe³⁺识别能力的荧光强度变化的荧光发射图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。

图6是本发明实施例11中的荧光探针化合物ⅳ-4+fe³⁺离子络合物的荧光强度分别随时间变化的荧光发射图(555nm)。横坐标为time(min)，纵坐标为荧光强度。

图7是本发明实施例12中的荧光探针化合物ⅳ-4+金属离子络合物(ⅳ-4+metalions)与ⅳ-4+fe³⁺+金属离子络合物(ⅳ-4+metalions+fe³⁺)的荧光强度比较柱状图(555nm)。横坐标为金属离子，纵坐标为荧光强度。

图8是本发明实施例13中的荧光探针化合物ⅳ-4与不同浓度fe³⁺(0-30倍量)的荧光强度变化图(a)横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度和fe³⁺的浓度与荧光强度的变化线性图(b)。

图9是本发明实施例13中的荧光探针化合物ⅳ-4+fe³⁺离子络合物的job’splot曲线图，横坐标为[fe³⁺]/[fe³⁺]+[ⅳ-4]，纵坐标为紫外吸收值od值。

图10是本发明实施例15中的荧光探针化合物ⅳ-4与fe³⁺的可逆性实验的荧光强度变化图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。

图11是本发明实施例15中的荧光探针化合物ⅳ-4与fe³⁺的识别机理图。

图12是本发明实施例16中的荧光探针化合物ⅳ-4识别环境水样中不同浓度fe³⁺的溶液颜色可视变化图，图中从左到右fe³⁺溶液浓度依次为0，0.05，5.0，10.0mm。

(五)具体实施方式

本发明所述超纯水是指去离子水经过一次蒸馏得到的蒸馏水，所述室温为25-30℃。下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：化合物(ii)的合成

罗丹明6g(化合物i)(1.25mmol，1.0eq，0.6g)溶于25ml的甲醇试剂(分析级)中，完全溶解后溶液呈现红褐色，再滴加炔丙胺(6.25mmol，5.0eq，0.34g)，滴加结束后，加热回流反应24h，反应过程用tlc追踪检测。反应完全后用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后加入30ml水，二氯甲烷进行萃取(3×50ml)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂，后进行薄层层析(ch3oh:ch2cl2＝1:20，v/v为展开剂)，收集rf为0.4-0.5的组分，干燥，得到化合物ii。

compoundii(粉色固体，产率65％)ms(esi):m/z＝452.2[m+h]⁺.mp＝259-261℃.¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.02–7.88(m,1h),7.48–7.37(m,2h),7.11–7.02(m,1h),6.36(s,2h),6.28(s,2h),3.93(d,j＝2.5hz,2h),3.53(dd,j＝45.2,5.3hz,2h),3.29–3.14(m,4h),1.90(s,6h),1.81–1.73(m,1h),1.32(t,j＝7.2hz,6h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ167.63,154.02,151.86,147.50,132.71,130.25,128.81,128.01,123.76,123.08,117.73,105.46,96.60,78.37,77.28,77.03,76.78,70.05,64.99,38.40,28.65,16.66,14.76.irνmax(cm^-1):3442.53,3278.00,2964.43,2929.15,2870.13,1704.041621.33,1517.19,1446.13,1383.59,1158.70,938.78,811.98,664.70.

实施例2：化合物(ⅳ-1)的合成

化合物ii(0.1mmol，2.2eq，0.04g)溶于20ml的无水四氢呋喃中，加入化合物iii-1(1.0eq)，以cu⁺作为催化剂(加入五水硫酸铜(1.2eq)和vc(1.2eq)生成cu⁺(1.2eq)。反应在55℃左右进行8-12h，反应过程用tlc追踪检测。反应完全后，反应液浓缩至干，然后加入30ml水，二氯甲烷萃取(3×50ml)，合并有机相，再用饱和氯化钠水溶液洗涤(2×100ml)，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸干溶剂，薄层层析(ch3oh:ch2cl2＝1:20，v/v为展开剂)，收集rf为0.4-0.5的组分，干燥，得到目标产物ⅳ-1。

compoundⅳ-1(白色固体，产率35％)ms(esi):m/z＝1001.5[m+h]⁺.mp＝259-261℃.¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.07–7.94(m,2h),7.55–7.33(m,4h),7.17(s,1h),7.14–6.98(m,2h),6.94–6.86(m,1h),6.32(s,1h),6.28(d,j＝6.0hz,1h),6.18–6.06(m,2h),5.86(s,1h),5.79(d,j＝11.4hz,1h),5.32(d,j＝17.7hz,2h),4.56(s,1h),4.47(s,1h),3.28–3.12(m,6h),2.97(t,j＝16.0hz,2h),1.88–1.80(m,6h),1.61(s,12h),1.31(t,j＝7.1,4.8hz,6h),1.23(dd,j＝13.7,6.5hz,6h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ168.10,153.82,152.70,151.73,147.28,144.10,132.65,130.62,128.43,128.03,123.80,123.62,122.92,117.60,115.85,105.58,96.60,77.24,77.03,76.82,66.95,65.15,49.14,38.35,35.14,29.70,16.64,16.56,14.75.irνmax(cm^-1):3440.66,2968.25,1621.43,1517.46,1421.56,1269.83,1216.44,1093.80,877.48,700.58,655.77.

实施例3：化合物(ⅳ-2)的合成

化合物ii(0.1mmol，2.2eq，0.04g)溶于20ml的无水四氢呋喃中，加入化合物iii-2(1.0eq)，以cu⁺作为催化剂(加入五水硫酸铜(1.2eq)和vc(1.2eq)生成cu⁺)。其他同实施例2，得到目标产物ⅳ-2。

compoundⅳ-2(白色固体，产率40％)ms(esi):m/z＝1015.5[m+h]⁺.¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.94(dd,j＝9.6,3.7hz,2h),7.52–7.41(m,4h),7.27(d,j＝6.4hz,1h),7.04(t,j＝5.7hz,2h),6.70(d,j＝6.2hz,2h),6.30(d,j＝6.0hz,4h),6.08(d,j＝5.6hz,4h),4.42(d,j＝5.9hz,2h),4.32(d,j＝6.1hz,2h),3.22–3.12(m,8h),1.83(d,j＝5.7hz,12h),1.28(dd,j＝13.4,6.9hz,15h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ167.63,154.01,151.83,147.49,132.73,130.22,128.79,128.01,123.75,123.07,117.73,105.40,96.58,78.35,77.26,77.05,76.84,70.06,64.98,38.39,29.71,28.64,16.68,14.76.irνmax(cm^-1):3397.93,2967.70,1689.81,1620.99,1518.51,1384.09,1270.71,1217.46,1141.17,1092.13,1014.56,875.81,738.93,689.08,540.26.

实施例4：化合物(ⅳ-3)的合成

化合物ii(0.1mmol，2.2eq，0.04g)溶于20ml的无水四氢呋喃中，加入化合物iii-3(1.0eq)，以cu⁺作为催化剂(加入五水硫酸铜(1.2eq)和vc(1.2eq)生成cu⁺)。其他同实施例2，得到目标产物ⅳ-3。

compoundⅳ-3(淡黄色固体，产率40％)ms(esi):m/z＝1043.3[m+h]⁺.

¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.98–7.92(m,2h),7.49–7.42(m,4h),7.09–7.03(m,2h),7.01(d,j＝21.3hz,2h),6.34(d,j＝21.1hz,4h),6.06(d,j＝31.8hz,4h),4.44(s,4h),4.15–4.07(m,4h),3.29(t,j＝6.6hz,4h),3.20(dd,j＝7.2,4.0hz,4h),1.83(s,12h),1.51(dt,j＝10.1,6.6hz,4h),1.34–1.30(m,12h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ168.07,153.67,151.84,147.32,144.33,132.64,130.76,128.46,128.07,123.85,122.93,122.17,117.56,105.68,96.63,77.25,77.04,76.82,65.18,50.67,49.11,38.36,35.27,27.26,25.83,16.61,14.75.irνmax(cm^-1):3427.73,2968.69,269.42,2097.17,1620.87,1518.23,1421.34,1384.02,1269.56,1158.01,1091.99,1014.16,920.76,774.84.

实施例5：化合物(ⅳ-4)的合成

化合物ii(0.1mmol，2.2eq，0.04g)溶于20ml的无水四氢呋喃中，加入化合物iii-4(1.0eq)，以cu⁺作为催化剂(加入五水硫酸铜(1.2eq)和vc(1.2eq)生成cu⁺)。其他同实施例2，得到目标产物ⅳ-4。

compoundⅳ-4(粉白固体，产率45％)ms(esi):m/z＝1057.5[m+h]⁺.¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.95(dd,j＝6.2,2.0hz,2h),7.50–7.40(m,4h),7.10–6.97(m,4h),6.32(s,4h),6.09(s,4h),4.44(s,4h),4.15–3.97(m,4h),3.96–3.80(m,4h),3.75(dd,j＝11.2,5.4hz,4h),3.31–3.09(m,12h),1.86–1.78(m,16h),1.40–1.25(m,14h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ168.10,153.70,151.81,147.30,144.22,132.65,130.72,128.45,128.06,123.84,122.92,122.18,117.54,105.65,104.09,96.62,77.24,77.03,76.82,67.11,66.04,65.18,61.68,51.05,49.49,38.36,35.27,32.43,32.02,29.62,28.24,23.68,23.51,16.63,14.75.irνmax(cm^-1):3428.86,2966.31,2095.48,1681.38,1620.92,1518.05,1420.44,1384.36,1269.70,1201.42,1092.26,877.09,771.54.

实施例6：化合物(ⅳ-5)的合成

化合物ii(0.1mmol，2.2eq，0.04g)溶于20ml的无水四氢呋喃中，加入化合物iii-5(1.0eq)，以cu⁺作为催化剂(加入五水硫酸铜(1.2eq)和vc(1.2eq)生成cu⁺)。其他同实施例2，得到目标产物ⅳ-5。

compoundⅳ-5(粉色固体，产率40％)ms(esi):m/z＝1071.5[m+h]⁺.mp＝253-255℃.¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.00–7.92(m,2h),7.51–7.40(m,4h),7.09–6.95(m,4h),6.32(s,4h),6.14–6.04(m,4h),4.44(s,4h),4.08(dd,j＝16.9,9.5hz,4h),3.25(t,j＝6.8hz,4h),3.26–3.14(m,8h),1.88–1.79(m,12h),1.77–1.67(m,4h),1.59–1.52(m,4h),1.35–1.28(m,12h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ168.09,153.71,151.80,147.30,144.16,132.64,130.71,128.45,128.06,123.83,122.91,122.14,117.55,105.62,104.09,96.60,77.26,77.05,76.84,67.10,66.00,65.18,61.62,51.23,49.61,38.35,35.26,32.42,32.03,29.94,29.32,28.65,26.13,26.06,23.51,16.63,14.75.irνmax(cm^-1):3440.45,2931.24,2094.83,1621.36,1517.74,1420.61,1269.67,1200.83,1092.00,1013.83,876.99,812.60,743.93.

实施例7化合物(ⅳ-6)的合成

化合物ii(0.1mmol，2.2eq，0.04g)溶于20ml的无水四氢呋喃中，加入化合物iii-6(1.0eq)，以cu⁺作为催化剂(加入五水硫酸铜(1.2eq)和vc(1.2eq)生成cu⁺)。其他同实施例2，得到目标产物ⅳ-6。

compoundⅳ-6(白色固体，产率35％)ms(esi):m/z＝1059.5[m+h]⁺.mp＝263-266℃.¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.93(dd,j＝19.3,7.1hz,2h),7.41–7.29(m,4h),6.77(d,j＝7.6hz,2h),5.93(s,7h),4.27–4.17(m,4h),3.99–3.80(m,7h),3.79–3.52(m,8h),3.26–3.04(m,8h),2.05–1.79(m,12h),1.39–1.26(m,12h).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ166.58,152.96,150.77,146.43,131.69,129.17,127.76,126.97,122.71,122.03,116.68,104.34,95.51,77.30,76.20,75.99,75.78,69.02,63.91,37.35,28.68,27.60,15.65,13.72.irνmax(cm^-1):3397.93,2967.70,1689.81,1620.99,1518.51,1384.09,1270.71,1217.46,1141.17,1092.13,1014.56,875.81,738.93,689.08,540.26.

实施例8探针ⅳ-1～ⅳ-6的金属离子选择性

(1)探针母液的制备

准确称取所实施例2-7制备的探针分子粉末(ⅳ-1)～(ⅳ-6)，用色谱级乙腈溶解制成5μmol/ml的探针乙腈溶液。避光低温储存。

(2)金属离子母液的制备

分别称取无机盐mgso4·7h2o、kcl、cuso4·5h2o、fecl3、feso4·7h2o、mnso4·h2o、al(no3)3·9h2o、cacl2、nacl、agno3、pb(ch3coo)2·3h2o、co(no3)2·6h2o、bacl2·2h2o、zn(ch3coo)2·2h2o、niso4·6h2o、crcl3·6h2o、licl2·h2o、hgcl2、rucl3，转入10ml离心管中用超纯水定容至8ml，得到浓度为1.25mmol/ml的金属离子母液，分别对应离子为mg²⁺、k⁺、cu²⁺、fe³⁺、fe²⁺、mn²⁺、al³⁺、ca²⁺、na⁺、ag⁺、pb²⁺、co²⁺、ba²⁺、zn²⁺、ni²⁺、cr³⁺、li²⁺、hg²⁺、ru²⁺。避光低温储存。

(3)探针ⅳ-1～ⅳ-6的金属离子选择性

室温下，含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液中，测定各探针分子ⅳ-1～ⅳ-6对fe³⁺的选择性。

将步骤(2)中1.25mmol/ml的金属离子母液用超纯水稀释至12.5μmol/ml后取100μl，加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液100μl，再分别加入步骤(1)中的5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-1～ⅳ-6)10μl后，测定其相应荧光光谱，结果见图5所示。

从图5可以看出在化合物ⅳ-1～ⅳ-6系列探针中，化合物ⅳ-4对fe³⁺的识别能力最强，化合物ⅳ-2和ⅳ-6对fe³⁺的识别能力最弱，这可能是因为在不同链长情况下，五碳链的烷烃链可以提供三价铁离子与探针络合的最佳空间位置，且烷烃链中若有氧离子存在会影响识别效果。

实施例9探针ⅳ-4的金属离子选择性

室温下，含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液中，测定ⅳ-4探针分子对金属离子的选择性。

将12.5μmol/mlfe³⁺水溶液100μl，加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液100μl，再加入5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-4)10μl后，测定其相应荧光性能变化。同样条件下，将fe³⁺分别替换为al³⁺、mg²⁺、k⁺、cu²⁺、fe³⁺、fe²⁺、mn²⁺、ca²⁺、na⁺、ag⁺、pb²⁺、co²⁺、ba²⁺、zn²⁺、ni²⁺、cr³⁺、li²⁺、hg²⁺、ru²⁺，反应后溶液颜色变化，紫外吸收和荧光强度的变化，得到的相应的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，分别如图1、图2、图3所示。

从图1看出，化合物ⅳ-4在fe³⁺前没有颜色，加入fe³⁺以后，化合物ⅳ-4溶液变为红色，荧光下溶液颜色显黄色，且实验证明加入fe³⁺外的其他金属离子没有颜色。从图2和图3中可以看出化合物ⅳ-4对fe³⁺有较好的选择性，其紫外吸收光谱在530nm以上几乎没有吸收峰且化合物ⅳ-4的荧光发射也很弱；紫外-可见光谱在530nm处出现强的吸收峰，而且吸收强度增加了约4.5倍。根据紫外吸收光谱，在测定荧光光谱时，选择490nm为激发波长，化合物ⅳ-4与fe³⁺在555nm处有强的荧光发射波长，而且荧光强度大幅度增强，证明化合物的内酰胺环已经打开。唯一值得一提的是当加入相同倍数的al³⁺后，引起了一定的紫外吸收增强和荧光增强，但是在相同条件下，al³⁺诱导的荧光增强要远低于fe³⁺引起的紫外吸收和荧光增强，这说明化合物ⅳ-4对fe³⁺的选择性受到其他共存离子的干扰较弱，表现出对fe³⁺的高效的选择性。

实施例10ph对探针ⅳ-4的识别性能的影响

为了能够将探针ⅳ-4应用在更复杂体系中，实验过程中考察了ph对fe³⁺识别性能的影响。室温下，利用ph3.5-12.0范围内的含体积浓度50％乙腈的pbs溶液测定探针ⅳ-4和探针ⅳ-4+fe³⁺的荧光强度的变化。

将12.5μmol/mlfe³⁺水溶液100μl，分别加入不同ph(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0)的含体积浓度50％乙腈的pbs缓冲液100μl，再加入5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-4)10μl后，在555nm处测定其相应荧光值变化。同样条件下以不加fe³⁺水溶液作为对照。结果见图4所示。

如图4显示的是在含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液中，探针ⅳ-4溶液中没有fe³⁺存在和有fe³⁺存在时不同ph条件下，以490nm为激发波长，记录发射波长555nm处的荧光强度的变化。从图中可以看出，没有fe³⁺存在时，在ph为3.5到11.5之间没有观察到明显的荧光变化，说明探针ⅳ-4本身对ph不敏感。当加入fe³⁺后，在相同的ph范围内，探针对fe³⁺响应有所不同，当ph<7.0时荧光强度较强，ph＝5.5时，荧光强度最强。当溶液为碱性时，fe³⁺与探针ⅳ-4的结合能力减弱，不再有明显的荧光。总的来说，探针ⅳ-4能在一个较宽的ph范围内(ph3.5-9)实现对fe³⁺的有效识别。考虑到实验过程其他离子的作用环境，所以在接下来的性能测试中，选用含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液作为溶剂体系。

实施例11探针化合物ⅳ-4对fe³⁺的时间响应

室温下，含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液中，测定探针分子ⅳ-4对fe³⁺的识别性能。

将12.5μmol/mlfe³⁺水溶液100μl，加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液100μl，再加入5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-4)10μl后，分别在120min内，每隔5min在555nm处测定其相应荧光值变化，以确定作用时间的长短。结果见图6所示。

从图6中发现，5min内化合物ⅳ-4与fe³⁺反应即可产生荧光，说明探针本身具有良好的灵敏性，随着时间增长所产生的荧光强度也随之增强，在45min后达到最大的荧光强度，且随时间增强，荧光强度稳定，并无明显的下降。这表明探针ⅳ-4对fe³⁺的识别具有快的响应以及长时间识别的稳定性。这种实时监测在实际应用中具有重要意义。因此，在之后测试工作中每个样品都是加入金属离子放置30-40min后进行光谱测定的。

实施例12探针化合物ⅳ-4对fe³⁺的抗干扰性实验

室温下，含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液乙中，探针分子ⅳ-4对fe³⁺的识别性能。

分别将实施例8步骤(2)中1.25mmol/ml的金属离子母液(mg²⁺、na⁺、cu²⁺、k⁺、al³⁺、fe²⁺、ca²⁺、ag⁺、ba²⁺、co²⁺、pb²⁺、zn²⁺、mn²⁺、ni²⁺、cr³⁺、fe³⁺、li⁺、ru²⁺、hg²⁺)用超纯水稀释至12.5μmol/ml后取100μl，加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液100μl，再加入5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-4)10μl后，以不含金属离子作为空白对照，在555nm处测定荧光值，见图7中灰色柱。

在上述各金属离子溶液中再加入12.5μmol/mlfe³⁺水溶液100μl，在555nm处测定荧光值，见图7中黑色柱，通过两次测定荧光强度的比较得出其离子的存在对fe³⁺的影响。

如图7所示，灰色的柱状图说明除铁离子外，其它离子不会引起强烈的荧光发射的变化，而在上述溶液基础上，再加入同样当量的fe³⁺溶液后，可以看到荧光强度急剧增加(黑色柱状)。结果表明，化合物ⅳ-4对fe³⁺的识别作用受其他共存离子的干扰较小，因此，证明了ⅳ-4对fe³⁺有好的选择性。

实施例13探针ⅳ-4对fe³⁺的荧光滴定及络合比的测定

1)、探针ⅳ-4对fe³⁺的滴定及拟合

室温下，向含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液中，加入5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-4)10μl，进行fe³⁺的滴定实验，即向其中滴定5μmol/mlfe³⁺水溶液，每滴加完10μl测定溶液一次荧光发射光谱，到第30次10μl滴定完结束滴定，共测31次(即对探针(ⅳ-4)进行fe³⁺0-30.0倍量的滴定实验)。结果见图8所示。

从图8中可以看出，随着fe³⁺浓度的增加，在555nm处荧光发射强度逐渐增强，当加入到15.0倍量左右的fe³⁺后，反应基本达到饱和，溶液的荧光强度增强不明显。通过荧光强度随fe³⁺浓度的变化规律可以计算出络合物的结合常数，假设fe³⁺与化合物ⅳ-4的结合比1:1，通过origin软件按以下方程对化合物ⅳ-4的荧光强度随fe³⁺的浓度的变化图进行非线性最小二乘法的拟合，可以得到一条平滑曲线(图8中b)，线性相关系数r值大于0.99，有力的证明了假设是成立的，fe³⁺与化合物ⅳ-4的结合比为1:1，同时计算出结合常数值是2.25×10⁵m^-1，结合常数如此大说明了此络合物具有较好的稳定性。

公式(1)中，y代表加入离子后的荧光强度；y0代表有机化合物的荧光强度；ylim代表加入离子后的荧光强度变化的极限值；cm代表所加金属离子的浓度；cl代表有机化合物的浓度；ks为结合常数。

2)探针ⅳ-4与fe³⁺结合比的测定

为了进一步说明ⅳ-4与fe³⁺是1:1结合的，依据随fe³⁺的摩尔分数增高与紫外吸收值的变化做出job’splot曲线图(图9)。从图中可知，ⅳ-4与fe³⁺的总浓度是100μm，当fe³⁺的摩尔分数为0.5时，荧光发射强度达到最大值，这说明4d与fe³⁺的结合比是1:1，与上述非线性拟合是一致的。

实施例14fe³⁺浓度与探针ⅳ-4荧光强度变化关系的回归方程的确定

为了开发该探针的实际应用价值，进行了fe³⁺浓度与探针ⅳ-4荧光强度变化关系的回归方程的实验确定，具体实验方法为：将实施例8中1.25mmol/ml的fe³⁺离子母液用超纯水稀释后使其浓度分别为0，0.01,0.05,0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5μmol/ml，各取100μl，加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液100μl，再加入5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-4)10μl后，在555nm测定荧光强度。根据所测fe³⁺离子浓与其对应荧光强度数据的关系，得出以fe³⁺浓度(μmol/ml)为自变量x、荧光强度为因变量y的回归方程y＝251.625+2526.47x。

实施例15探针ⅳ-4对fe³⁺的识别可逆性的测定

室温下，含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液100μl，12.5μmol/mlfe³⁺水溶液100μl，加入5μmol/ml探针ⅳ-4乙腈溶液10μl后，观察反应荧光的变化情况，测定荧光光谱，结果见图10中曲线a。加入过量的etda络合剂，观察反应荧光的变化情况，再次测定荧光光谱，结果见图10中曲线b。最后再向其中加入12.5μmol/ml的fe³⁺水溶液100μl，观察反应荧光的变化情况，测定荧光光谱，结果见图10中曲线c。

在化合物ⅳ-4与三价铁离子溶液反应后，溶液由无色变为粉红色，测定此时的荧光强度值，在此溶液中加入过量edta后，溶液颜色变浅，再次测定此时荧光强度值。再加入相同当量的fe³⁺后溶液颜色有所恢复，但比最开始弱，这可能是因为溶液存在有过量的edta，其作为络合物也会与fe³⁺络合，从而影响fe³⁺与探针ⅳ-4的络合，并再次测定荧光值。这说明ⅳ-4与fe³⁺之间存在着配位作用，且fe³⁺与ⅳ-4间络合常数比较大，配位较强，加入fe³⁺使ⅳ-4中内酰胺环打开，加入的edta可将fe³⁺从探针体系中消除，实验可说明探针ⅳ-4对于fe³⁺的识别过程是可逆的。

根据ⅳ-4与fe³⁺之间的结合比为1:1，以及可逆性实验，判断该类探针对fe³⁺的识别机理如图11所示。

实施例16探针ⅳ-4d在定性检测水样中fe³⁺的应用

探针ⅳ-4经过光谱检测实验后，将其初步应用于环境水样中的金属离子fe³⁺检测中，取不同浓度梯度fe³⁺水溶液，对于水样中不同浓度的fe³⁺与探针作用后可以产生可视化的不同的颜色变化，进行定性检测水样中fe³⁺的。实施方法如下：

分别取4份0.2ml不同浓度梯度fe³⁺水溶液(0，0.05，5.0，10.0μm)样品，加入含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液200μl，加入5μmol/ml探针ⅳ-4乙腈溶液0.02ml，具体颜色变化见图12。

图12:从左到右分别为0，0.05，5.0，10.0μm浓度梯度的fe³⁺溶液，颜色逐渐由无色变为红色。

实施例17探针ⅳ-4在定量检测水样中fe³⁺浓度的应用

为了验证探针ⅳ-4在检测水样中fe³⁺的应用性能，分别用超纯水配制了7.5、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001μmol/ml的fe³⁺水溶液，作为待测样品。采用本发明探针方法和邻菲啰啉法测定来测定上述fe³⁺溶液的浓度，具体操作如下：

(1)本发明探针方法测定fe³⁺溶液的浓度分别取100μl含体积浓度50％乙腈的ph＝6.5、10mmpbs缓冲液，分别加入到100μl上述配制好的不同浓度的fe³⁺水溶液中，再分别加入5μmol/ml探针乙腈溶液(ⅳ-4)10μl后，在555nm处测定荧光强度。将测得的荧光值代入到实施例14得到的回归方程y＝251.625+2526.47x中，获得fe³⁺浓度，见表1。

(2)邻菲啰啉法测定fe³⁺溶液的浓度

a、乙酸-乙酸钠缓冲溶液(ph＝4.5)的配制：称取164g乙酸钠，溶于500ml超纯水中，加入84ml冰乙酸，用超纯水稀释到1000ml。

b、20g/l抗坏血酸溶液的配制：溶解10.0g抗坏血酸于200ml超纯水中，加入0.2g乙二胺四乙酸二钠(edta)和8.0ml甲酸，再用超纯水稀释到500ml，摇匀，贮存于棕色瓶中。

c、2.0g/l邻菲啰啉溶液的配制：称取2.0g邻菲啰啉，溶于800ml超纯水中，再用超纯水稀释到1000ml。

d、40.0g/l过硫酸钾溶液的配制：称取4.0g过硫酸钾，用超纯水溶解并定溶到100ml。

e、0.1mg/ml硫酸铁铵标准溶液i的配制：称取0.863g硫酸铁铵，置于200ml烧杯中，加入100ml超纯水，10ml浓硫酸，溶解后定溶到1000ml。

f、0.01mg/ml硫酸铁铵标准溶液ii的配制：取1ml0.1mg/ml硫酸铁铵标准溶液i，稀释10倍，只限当日使用。

g、工作曲线的绘制：分别取0ml(空白)、1.00ml、2.00ml、4.00ml、6.00ml、8.00ml、10.00ml步骤f配制的硫酸铁铵标准溶液ii于7个100ml容量瓶中，加超纯水至约40ml，加0.50ml硫酸溶液(水与质量浓度98％浓硫酸体积比为1：35配制)，ph值调到2，加3.0ml步骤b中配制的20g/l抗坏血酸溶液，10ml步骤a中配制的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，5ml步骤c中配制的邻菲啰啉溶液。用超纯水稀释至刻度，摇匀。室温下放置15分钟，用分光光度计于510nm处，以试剂空白调零测吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，相对应的fe³⁺量(μmol)为横坐标绘制得工作曲线y＝0.00064+0.37936x。

h、三价铁离子浓度的测定：取8ml待测样品到100ml容量瓶中，加超纯水至约40ml，用硫酸溶液(水与质量浓度98％浓硫酸体积比为1：35配制)将ph值调到2(必要时可用铵水调节)，加3.0ml步骤b中配制的20g/l抗坏血酸溶液，10ml步骤a中配制的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，5ml步骤c中配制的邻菲啰啉溶液。用超纯水稀释至刻度，摇匀。室温下放置15分钟，用分光光度计于510nm处，以试剂空白调零测吸光度，结果见表1。

以μmol/ml为单位铁离子的浓度c按下式计算：

c＝m/(55.8434*v)

m:以μg表示的铁离子的量；

v：以ml表示的试样体积。

表1探针ⅳ-4在检测水样中fe³⁺的应用

从上表1中，本发明所用的三价铁离子的探测方法误差小、灵敏度高、准确度高等特点，尤其在检测低浓度的三价铁离子，更显示出优越的灵敏度和准确度。