本发明涉及养殖淡水底改剂领域，尤其是涉及淡水复合微生物底改剂的制备方法。技术背景池塘既是养殖鱼类及其他水生生物生长的环境，又是其分泌物、排泄物的处理场所，由于养殖生产过程中大量进行投饲后，残饵及水生生物的粪便、尸体、死亡藻类不断增加而又无法排除池外，沉积于池底，在池塘底部形成一层黑色淤泥。淤泥中的有机物在缺氧条件下发酵分解产生大量的不利于鱼类及水生生物生长的物质，如氨、硫化氢、甲烷、氢、有机酸、硫醇、低级胺类等，这些物质不仅直接危害养殖鱼类及水生生物，而且会使整个池塘环境的水质恶化，ph值降低，从而影响养殖品种的新陈代谢和生长发育，导致饲料系数增大，养殖成本升高，甚至引起养殖品种中毒死亡，对养殖周期的经济效益造成重大损失。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种淡水复合微生物底改剂的制备方法，本制备方法简单易行，制备过程中多糖的产量与产率较高，终产物底改剂的机械强度与稳定性较高，传质性能与成球性能较好，淡水复合微生物底改剂通过絮凝、酶降解、微生物降解三种强效作用对养殖污水进行改良，其生物分解性全面，安全性高，无毒无害且无二次污染。本发明方法中所用到的微生物及其购买企业为：红平红球菌，上海研生生化试剂有限公司；酿酒酵母菌，烟台曼森商贸有限公司；枯草芽孢杆菌、酵母菌，沧州市益宏动物保健品有限公司；小球藻，西安天广源生物科技有限公司；放线菌，扬州市海诚生物技术有限公司；纳豆芽孢杆菌，广州绿辉生物科技有限公司。本发明针对
背景技术：
：中提到的问题，采取的技术方案为：淡水复合微生物底改剂的制备方法，包括：配制发酵培养基、发酵、吸附、交联，具体包括以下步骤：配制发酵培养基：以200～220份麸皮粉为主料、30～50份玉米芯粉为辅料，另添加1.5～2.5份蜂蜜、3～4份蔗糖，添加淀粉废水至干物含量为45～55%，灭菌后加入1.2～1.5份发酵增效剂即得发酵培养基；利用淀粉废水与麸皮粉、玉米芯粉制备发酵培养基，不仅实现了废物利用，保护了环境，而且还实现了物料的增值，培养基中较高的水分有利于营养物质为微生物所摄取，可以促进微生物生长、酶促反应的进行与发酵产热的散发，从而提高了发酵的效率与代谢物的产量；发酵：将混合种子液按发酵培养基干重的10.8～12.2%接种入发酵培养基中，搅拌均匀，置于35～37℃、150～160r/min条件下的恒温培养箱中发酵60～72h；取发酵液于6000～8000r/min、2～4℃条件下离心10～30min，收集上清液与3～5倍体积的丙酮充分混合，24～36h后采用相同条件进行离心提纯，将离心后获得的沉淀物真空干燥，获得微生物絮凝剂；通过微生物所产生的酶作用于麸皮底物，有助于麸皮多糖的释放，使更多的麸皮多糖不再被各种牢固的化学键所束缚，使其直接游离出来，而不需要过高的温度破坏化学键以使其脱离；污水处理时，在助凝剂氯化钙存在的条件下，钙离子通过库仑引力将带负电荷的胶体颗粒拉近，并与之形成钙离子-胶体颗粒结合物，进而减小了胶体颗粒的扩散双电层的厚度，拉近了胶体颗粒之间的距离，微生物絮凝剂像一种桥接剂，主要通过其功能基团和钙离子之间的离子键将两个或两个以上的钙离子-胶体颗粒结合物吸附到絮凝剂高分子链上，从而完成了胶体颗粒的絮凝，钙离子-胶体颗粒结合物吸附到一条微生物絮凝剂分子链上的同时，可以吸附到其它絮凝剂分子链上，进而生成一种三维网状结构的絮凝体，絮凝体在迅速沉降的过程中快速网捕和卷扫胶体颗粒，最终达到理想的絮凝效果；吸附：将芝麻秸秆活性碳、酶液、微生物絮凝剂与微生物制剂按照质量比100:300～500:15～50:1.5～1.8均匀混合并进行吸附，吸附温度为22～24℃，恒温吸附3～5h得复合酶液；芝麻秸秆活性碳是多孔结构，其传质性能较强，与酶液、微生物絮凝剂、微生物制剂能够产生较大面积的接触，可以极大的提高附属物的活性及降解效率；交联：将质量比为1:3～5:1～2:5～8:12～20的聚乙二醇、海藻酸钠、氯化钙、去离子水与复合酶液混合得混合溶剂，其中聚乙二醇的分子量为500～1200、海藻酸钠的浓度为0.85～1.05mol/l、氯化钙的浓度为0.2～0.4mol/l；然后按照重量比1:1.8～2.2将溶剂滴加入交联剂中，控制温度为0～1℃，在冰水浴中搅拌交联5～30min，然后移至室温干燥45～60min即得到固定化微生物底改剂微球，将得到的固定化微生物底改剂微球用生理盐水冲洗3～5遍，即为淡水复合微生物底改剂；复合微生物底改剂的机械强度较高，耐物理冲击，传质性能与成球性能较高，同时复合微生物底改剂的稳定性很高，不易破裂分解，可以迅速、高效率地絮凝、降解污水污染物，无毒副残留，成本较低，适合规模化生产与应用，是一种安全、高效的淡水底改剂。作为优选，混合种子液为重量比为1:1～3:5～10的红平红球菌、酿酒酵母菌与枯草芽孢杆菌的混合菌液；选用混菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，可以降低单菌发酵的劣势，多种菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对多糖生成的不利因素，因此有利于麸皮多糖的发酵。作为优选，发酵增效剂包含下列含量的物质：55～80%的尿素、2～10%的α～萘乙酸钠、12～18%氧化钙、2.5～5.5%的硫酸镁、1.2～1.5%的磷酸二甲酯；尿素会发生氨化作用，麸皮、玉米芯粉经氨化处理后孔隙率增多，其与酶的接触面积增大，有利于多糖的产生；发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使枯草芽孢杆菌增强对乙酰辅酶a的分泌，进而增进其与草酰乙酸的缩合反应，加快柠檬酸的合成，可以大幅度提高枯草芽孢杆菌三羧酸循环的速度，加快枯草芽孢杆菌的生长繁殖与发酵代谢，使得更多的酶与发酵底物作用，进而提高多糖的产率。作为优选，酶液的制备步骤为：选取除污现场筛选出具有较高除污性能的小球藻进行培养，将培养7～15d并且处于对数生长期的小球藻液进行抽滤，滤膜选用0.35～0.45μm，取下含有小球藻的滤膜，液氮冷冻，之后加入3～4倍的pbs缓冲液，pbs缓冲液的ph为7.4～7.5，浓度为0.4～0.5mol/l；在1～2℃温度下进行研磨，研磨液倒入离心管并在1～2℃、10000～12000r/min的条件下离心15～30min，取出上清液即得酶液，放于1～2℃保存；从除污现场筛选出的小球藻内提取酶液作为固定化酶，其针对性较强，同时可以根据不同性质污水选择不同的藻液，小球藻产酶效率高，同时所产酶对污染物具有较高的降解性，低温下提取酶液不会对酶造成影响，具有较高的实用性。作为优选，交联剂为质量比为1:0.02～0.04:0.2～0.4:8～15的正硅酸甲酯、3,5-二氟苯甲酸、甲基三氧甲基硅烷和甲醇，在冰水浴中混合得交联剂；3,5-二氟苯甲酸的两个氟原子具有较大的负电性，可以强化糖链的蒂合，增强交联性，提高固定化微生物底改剂微球的机械强度与稳定性，增强耐冲击性，延长底改剂微球的使用期限，降低成本，耐物理冲击，提高底改剂微球的传质性能与成球性能，同时固定化微生物底改剂微球的稳定性很高，不易破裂分解，可以迅速、高效率地降解絮凝、降解污染物，无毒副残留，成本较低，适合规模化生产与应用，是一种安全、高效的淡水底改剂。作为优选，微生物制剂为重量比为1:0.5～0.8:0.3～0.5的放线菌、酵母菌、纳豆芽孢杆菌的混合微生物制剂；底改剂将污染水体中的蛋白质、淀粉、脂肪等污染物絮凝团聚后沉降至水底，在沉降的过程中与沉降完成后，固定化微生物底改剂微球中的酶制剂与微生物制剂中的放线菌、酵母菌、纳豆芽孢杆菌可以对有机污染物进行降解，通过絮凝、酶降解、微生物降解三种强效作用对养殖污水进行改良，其生物分解性全面，安全性高，无毒无害且无二次污染。与现有技术相比，本发明的优点在于：1）发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使枯草芽孢杆菌增强对乙酰辅酶a的分泌，进而加速其与草酰乙酸缩合合成柠檬酸，大幅度提高枯草芽孢杆菌三羧酸循环的速度，加快枯草芽孢杆菌的生长繁殖与发酵代谢，使得更多的酶与发酵底物作用，进而提高多糖的产率；2）交联剂中的3,5-二氟苯甲酸的两个氟原子具有较大的负电性，可以强化糖链的蒂合，增强交联性，提高固定化微生物底改剂微球的机械强度与稳定性，增强耐冲击性，延长底改剂微球的使用期限，降低成本，耐物理冲击，提高底改剂微球的传质性能与成球性能；3）淡水复合微生物底改剂将污染水体中的污染物絮凝团聚后沉降至水底，在沉降的过程中与沉降完成后，底改剂微球中的酶制剂与微生物制剂中的微生物制剂可以对有机污染物进行降解，通过絮凝、酶降解、微生物降解三种强效作用对养殖污水进行改良，其生物分解性全面，安全性高，无毒无害且无二次污染。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：淡水复合微生物底改剂的制备方法，包括以下步骤：1）以200份麸皮粉为主料、30份玉米芯粉为辅料，另添加1.5份蜂蜜、3份蔗糖，添加淀粉废水至干物含量为45%，灭菌后加入1.2份发酵增效剂即得发酵培养基；发酵增效剂包含下列含量的物质：75%的尿素、5%的α-萘乙酸钠、14%氧化钙、4.8%的硫酸镁、1.2%的磷酸二甲酯；2）将混合种子液按发酵培养基干重的10.8%接种入发酵培养基中，混合种子液为重量比为1:1:5的红平红球菌、酿酒酵母菌与枯草芽孢杆菌的混合菌液，搅拌均匀，置于35℃、150r/min条件下的恒温培养箱中发酵60h；取发酵液于6000r/min、2℃条件下离心10min，收集上清液与3倍体积的丙酮充分混合，24h后采用相同条件进行离心提纯，将离心后获得的沉淀物真空干燥，获得微生物絮凝剂；3）将芝麻秸秆活性碳、酶液、微生物絮凝剂与微生物制剂按照质量比100:300:15:1.5均匀混合并进行吸附，微生物制剂为重量比为1:0.5:0.3的放线菌、酵母菌、纳豆芽孢杆菌的混合微生物制剂，吸附温度为22℃，恒温吸附3h得复合酶液；4）将质量比为1:3:1:5:12的聚乙二醇、海藻酸钠、氯化钙、去离子水与复合酶液混合得混合溶剂，其中聚乙二醇的分子量为500～1200、海藻酸钠的浓度为0.85mol/l、氯化钙的浓度为0.2mol/l；然后按照重量比1:1.8将溶剂滴加入交联剂中，交联剂为质量比为1:0.02:0.2:8的正硅酸甲酯、3,5-二氟苯甲酸、甲基三氧甲基硅烷和甲醇，控制温度为0℃，在冰水浴中搅拌交联5min，然后移至室温干燥45min即得到固定化微生物底改剂微球，将得到的固定化微生物底改剂微球用生理盐水冲洗3遍，即为淡水复合微生物底改剂。实施例2：淡水复合微生物底改剂的制备方法，包括以下步骤：1）配制发酵培养基：以220份麸皮粉为主料、50份玉米芯粉为辅料，另添加2.5份蜂蜜、4份蔗糖，添加淀粉废水至干物含量为55%，灭菌后加入1.5份发酵增效剂即得发酵培养基；利用淀粉废水与麸皮粉、玉米芯粉制备发酵培养基，不仅实现了废物利用，保护了环境，而且还实现了物料的增值，培养基中较高的水分有利于营养物质为微生物所摄取，可以促进微生物生长、酶促反应的进行与发酵产热的散发，从而提高了发酵的效率与代谢物的产量；2）发酵：将混合种子液按发酵培养基干重的12.2%接种入发酵培养基中，搅拌均匀，置于37℃、160r/min条件下的恒温培养箱中发酵72h；取发酵液于8000r/min、4℃条件下离心30min，收集上清液与5倍体积的丙酮充分混合，36h后采用相同条件进行离心提纯，将离心后获得的沉淀物真空干燥，获得微生物絮凝剂；通过微生物所产生的酶作用于麸皮底物，有助于麸皮多糖的释放，使更多的麸皮多糖不再被各种牢固的化学键所束缚，使其直接游离出来，而不需要过高的温度破坏化学键以使其脱离；3）吸附：将芝麻秸秆活性碳、酶液、微生物絮凝剂与微生物制剂按照质量比100:500:50:1.8均匀混合并进行吸附，吸附温度为24℃，恒温吸附5h得复合酶液；芝麻秸秆活性碳是多孔结构，其传质性能较强，与酶液、微生物絮凝剂、微生物制剂能够产生较大面积的接触，可以极大的提高附属物的活性及降解效率；4）交联：将质量比为1:5:2:8:20的聚乙二醇、海藻酸钠、氯化钙、去离子水与复合酶液混合得混合溶剂，其中聚乙二醇的分子量为500～1200、海藻酸钠的浓度为1.05mol/l、氯化钙的浓度为0.4mol/l；然后按照重量比1:2.2将溶剂滴加入交联剂中，控制温度为1℃，在冰水浴中搅拌交联30min，然后移至室温干燥60min即得到固定化微生物底改剂微球，将得到的固定化微生物底改剂微球用生理盐水冲洗5遍，即为淡水复合微生物底改剂；复合微生物底改剂的机械强度较高，耐物理冲击，传质性能与成球性能较高，同时复合微生物底改剂的稳定性很高，不易破裂分解，可以迅速、高效率地絮凝、降解污水污染物，无毒副残留，成本较低，适合规模化生产与应用，是一种安全、高效的淡水底改剂。混合种子液为重量比为1:3:10的红平红球菌、酿酒酵母菌与枯草芽孢杆菌的混合菌液。发酵增效剂包含下列含量的物质：78%的尿素、3%的α-萘乙酸钠、15%氧化钙、2.5%的硫酸镁、1.5%的磷酸二甲酯。酶液的制备步骤为：选取除污现场筛选出具有较高除污性能的小球藻进行培养，将培养15d并且处于对数生长期的小球藻液进行抽滤，滤膜选用0.45μm，取下含有小球藻的滤膜，液氮冷冻，之后加入4倍的pbs缓冲液，在2℃温度下进行研磨，研磨液倒入离心管并在2℃、12000r/min的条件下离心30min，取出上清液即得酶液，放于2℃保存。交联剂为质量比为1:0.04:0.4:15的正硅酸甲酯、3,5-二氟苯甲酸、甲基三氧甲基硅烷和甲醇，在冰水浴中混合得交联剂。微生物制剂为重量比为1:0.8:0.5的放线菌、酵母菌、纳豆芽孢杆菌的混合微生物制剂。实施例3：淡水复合微生物底改剂的制备方法，包括：配制发酵培养基、发酵、吸附、交联，具体包括以下步骤：配制发酵培养基：以200份麸皮粉为主料、40份玉米芯粉为辅料，另添加2份蜂蜜、3份蔗糖，添加淀粉废水至干物含量为50%，灭菌后加入1.2份发酵增效剂即得发酵培养基；利用淀粉废水与麸皮粉、玉米芯粉制备发酵培养基，不仅实现了废物利用，保护了环境，而且还实现了物料的增值，培养基中较高的水分有利于营养物质为微生物所摄取，可以促进微生物生长、酶促反应的进行与发酵产热的散发，从而提高了发酵的效率与代谢物的产量；发酵：将混合种子液按发酵培养基干重的12%接种入发酵培养基中，搅拌均匀，置于37℃、150r/min条件下的恒温培养箱中发酵60h；取发酵液于6500r/min、2℃条件下离心25min，收集上清液与4倍体积的丙酮充分混合，36h后采用相同条件进行离心提纯，将离心后获得的沉淀物真空干燥，获得微生物絮凝剂；通过微生物所产生的酶作用于麸皮底物，有助于麸皮多糖的释放，使更多的麸皮多糖不再被各种牢固的化学键所束缚，使其直接游离出来，而不需要过高的温度破坏化学键以使其脱离；污水处理时，在助凝剂氯化钙存在的条件下，钙离子通过库仑引力将带负电荷的胶体颗粒拉近，并与之形成钙离子-胶体颗粒结合物，进而减小了胶体颗粒的扩散双电层的厚度，拉近了胶体颗粒之间的距离，微生物絮凝剂像一种桥接剂，主要通过其功能基团和钙离子之间的离子键将两个或两个以上的钙离子-胶体颗粒结合物吸附到絮凝剂高分子链上，从而完成了胶体颗粒的絮凝，钙离子-胶体颗粒结合物吸附到一条微生物絮凝剂分子链上的同时，可以吸附到其它絮凝剂分子链上，进而生成一种三维网状结构的絮凝体，絮凝体在迅速沉降的过程中快速网捕和卷扫胶体颗粒，最终达到理想的絮凝效果；吸附：将芝麻秸秆活性碳、酶液、微生物絮凝剂与微生物制剂按照质量比100:400:25:1.6均匀混合并进行吸附，吸附温度为24℃，恒温吸附4h得复合酶液；芝麻秸秆活性碳是多孔结构，其传质性能较强，与酶液、微生物絮凝剂、微生物制剂能够产生较大面积的接触，可以极大的提高附属物的活性及降解效率；交联：将质量比为1:4:1:7:13的聚乙二醇、海藻酸钠、氯化钙、去离子水与复合酶液混合得混合溶剂，其中聚乙二醇的分子量为500～1200、海藻酸钠的浓度为1mol/l、氯化钙的浓度为0.3mol/l；然后按照重量比1:2将溶剂滴加入交联剂中，控制温度为1℃，在冰水浴中搅拌交联25min，然后移至室温干燥45min即得到固定化微生物底改剂微球，将得到的固定化微生物底改剂微球用生理盐水冲洗4遍，即为淡水复合微生物底改剂；复合微生物底改剂的机械强度较高，耐物理冲击，传质性能与成球性能较高，同时复合微生物底改剂的稳定性很高，不易破裂分解，可以迅速、高效率地絮凝、降解污水污染物，无毒副残留，成本较低，适合规模化生产与应用，是一种安全、高效的淡水底改剂。混合种子液为重量比为1:2:7的红平红球菌、酿酒酵母菌与枯草芽孢杆菌的混合菌液；选用混菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，可以降低单菌发酵的劣势，多种菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对多糖生成的不利因素，因此有利于麸皮多糖的发酵。发酵增效剂包含下列含量的物质：70%的尿素、10%的α-萘乙酸钠、15%氧化钙、3.8%的硫酸镁、1.2%的磷酸二甲酯；尿素会发生氨化作用，麸皮、玉米芯粉经氨化处理后孔隙率增多，其与酶的接触面积增大，有利于多糖的产生；发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使枯草芽孢杆菌增强对乙酰辅酶a的分泌，进而增进其与草酰乙酸的缩合反应，加快柠檬酸的合成，可以大幅度提高枯草芽孢杆菌三羧酸循环的速度，加快枯草芽孢杆菌的生长繁殖与发酵代谢，使得更多的酶与发酵底物作用，进而提高多糖的产率。酶液的制备步骤为：选取除污现场筛选出具有较高除污性能的小球藻进行培养，将培养10d并且处于对数生长期的小球藻液进行抽滤，滤膜选用0.4μm，取下含有小球藻的滤膜，液氮冷冻，之后加入4倍的pbs缓冲液，pbs缓冲液的ph为7.4，浓度为0.4mol/l；在2℃温度下进行研磨，研磨液倒入离心管并在2℃、10000r/min的条件下离心20min，取出上清液即得酶液，放于2℃保存；从除污现场筛选出的小球藻内提取酶液作为固定化酶，其针对性较强，同时可以根据不同性质污水选择不同的藻液，小球藻产酶效率高，同时所产酶对污染物具有较高的降解性，低温下提取酶液不会对酶造成影响，具有较高的实用性。交联剂为质量比为1:0.02:0.2:10的正硅酸甲酯、3,5-二氟苯甲酸、甲基三氧甲基硅烷和甲醇，在冰水浴中混合得交联剂；3,5-二氟苯甲酸的两个氟原子具有较大的负电性，可以强化糖链的蒂合，增强交联性，提高固定化微生物底改剂微球的机械强度与稳定性，增强耐冲击性，延长底改剂微球的使用期限，降低成本，耐物理冲击，提高底改剂微球的传质性能与成球性能，同时固定化微生物底改剂微球的稳定性很高，不易破裂分解，可以迅速、高效率地降解絮凝、降解污染物，无毒副残留，成本较低，适合规模化生产与应用，是一种安全、高效的淡水底改剂。微生物制剂为重量比为1:0.6:0.4的放线菌、酵母菌、纳豆芽孢杆菌的混合微生物制剂；底改剂将污染水体中的蛋白质、淀粉、脂肪等污染物絮凝团聚后沉降至水底，在沉降的过程中与沉降完成后，固定化微生物底改剂微球中的酶制剂与微生物制剂中的放线菌、酵母菌、纳豆芽孢杆菌可以对有机污染物进行降解，通过絮凝、酶降解、微生物降解三种强效作用对养殖污水进行改良，其生物分解性全面，安全性高，无毒无害且无二次污染。将实施例1～3中的淡水复合微生物底改剂的理化性质进行对比，其结果如表1所示，由表1可知，淡水复合微生物底改剂的机械强度与固定化程度较高，微球的传质性能与成球性较好，对淡水养殖水中的有机污染物具有较高的降解率。表1.实施例1～3中的淡水复合微生物底改剂的理化性质项目机械强度/mn传质性能/min成球性固定化效率/%降解率/%实施例181.526很好91.385.6实施例284.822很好94.889.2实施例380.227较好92.684.7本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12