本发明属于高通量测序领域，具体而言，涉及一种适用于扩增子文库构建的方法。
背景技术：
：扩增子靶向捕获技术是一种基于多重pcr反应的靶向捕获技术，它利用多重pcr反应，同时扩增多个目标区域序列，得到扩增子，然后采用酶连接或者pcr反应的方式，将测序接头序列引入到扩增子的两翼，得到扩增子文库，然后进行二代测序，获取目标区域的序列信息。随着二代测序技术的发展，常规的液相捕获方式流程分为：样品打断、构建文库和捕获目标区域文库。此过程从基因组的打断、建库到捕获结束，至少需要2天时间。目前主流的扩增子文库构建流程包含如下步骤：第1步，采用多重pcr反应同时扩增多个目标区域序列，得到扩增子产物；第2步，采用磁珠纯化扩增子产物，去除引物、酶、dntp和盐离子等杂质；第3步，以测序接头序列为引物，以扩增子产物为模板，进行接头序列pcr反应，将测序接头序列引入到扩增子的两翼，得到扩增子文库；第4步，采用磁珠对扩增子文库进行纯化，去除dna聚合酶、测序接头序列、底物和盐离子等杂质；第5步，对文库定量，然后进行二代测序，获取扩增子文库的序列。上述操作流程虽然比酶连接法构建扩增子文库的流程简便，但是应用于高通量样本的文库构建时，仍然步骤繁琐，耗时较长，制约文库构建的通量。技术实现要素：为了简化样品制备过程中繁琐的流程，本发明人提出了一种快速捕获建库的方法，通过本发明的方法可以迅速得到直接用于上机测序的大量文库。因此，在第一方面本发明提供了一种快速捕获建库的方法，所述方法包括：1)提取基因组dna，并将其打断成片段；2)用探针序列与所述打断的片段结合，所述探针序列中间部分是80-120个核苷酸的靶序列的互补序列，其两端分别带有第一接头序列和第二接头序列，所述第一接头序列和所述第二接头序列在所述探针序列的5’端和3’端有10-14个核苷酸反向互补；3)对上述结合产物进行连接反应成环状物；4)使用滚环引物对所述环状物进行滚环扩增，获得滚环扩增产物，所述滚环引物包括5’端第三接头序列和3’端与所述第一接头序列反向互补的序列；在所述滚环扩增时加入阻断探针扩增的阻断序列，所述阻断序列可结合在第一接头序列和第二接头序列相互的部分，阻止了以探针作为模板的扩增；5)使用第一引物和第二引物对所述滚环测序产物进行扩增，获得扩增产物，所述第一引物包括5’端的第四接头序列和3’端的第二接头序列，所述第二引物包括所述滚环引物的5’端序列。在一个实施方案中，所述方法还包括，将5)得到的扩增产物进行扩增。在一个实施方案中，所述第一接头序列和所述第二接头序列长度为15-25个核苷酸。在一个实施方案中，所述第一接头序列为第二测序引物反向互补的一部分。在一个实施方案中，所述第二接头序列为第一测序引物的一部分。在一个实施方案中，所述滚环引物包括5’端第三接头序列包括6-8个核苷酸和用于合成识别不同样本的标识序列。在一个实施方案中，所述滚环引物包括5’端的所述第二测序引物。在一个实施方案中，所述阻断序列包括第一接头反向互补序列5’端核苷酸+第二接头序列反向互补序列3’端核苷酸。在一个实施方案中，所述阻断序列为15-25个核苷酸。在一个实施方案中，所述阻断序列包括3’端的封闭基团，例如c3间臂封闭基团。在一个实施方案中，第一接头序列为seqidno.1，第二接头序列为seqidno.2，所述为阻断探针为seqidno.4。在一个实施方案中，所述第三接头为p7序列。在一个实施方案中，所述第四接头为p5序列。在一个实施方案中，所述滚环引物为seqidno.3，所述第一引物为seqidno.5，所述第二引物为seqidno.6。在一个实施方案中，所述第一接头序列为seqidno.1，第二接头序列为seqidno.2，所述为阻断探针为seqidno.4，所述第三接头为p7序列，所述第四接头为p5序列，所述滚环引物为seqidno.3，所述第一引物为seqidno.5，所述第二引物为seqidno.6。在第二方面，本发明还提供了本发明第一方面中涉及的探针序列、滚环引物、阻断序列、引物对第一引物和第二引物。本发明的方法探针的两端带有部分接头序列，在circligasetmiissdnaligase的作用下，靶序列与探针形成一个环化复合物，这样设计的优势有以下几点：(1)省去了文库构建过程，将文库构建与捕获过程结合在一起，大幅度地节约了制备上机文库的时间。(2)与传统的捕获测序相比较，省去了对捕获磁珠的消耗，大大节约了研发成本。(3)由于传统的捕获建库过程繁琐，不可避免地造成了对有效文库的损耗，而快速建库捕获方法，直接针对目标片段进行捕获，可以获取更为丰富的库容量。本发明的方法通过巧妙的引物对设计，有效地避免了探针直接成环的扩增，提高了有效文库的占比。具体设计思路如下：当两个探针成环之后，通过设计跨越2条探针两端接头部分序列进行引物设计，同时在引物的3’加上封闭基团，这样有效地避免了探针自身的大量扩增，提高了待测文库的有效浓度。本发明的方法与酶切方法比较，滚坏扩增与常规pcr技术巧妙结合，可以更为高效和简便地产生出直接用于上机测序文库。附图说明通过以下附图对本发明进行说明图1是seqidno.3引物结合在探针和目标序列形成的环复合物上，用于引发滚环扩增过程。具体实施方式为了简化样品制备过程中繁琐的流程，本发明人提出了一种快速捕获建库的方法，通过设计带有部分接头序列的dna探针，直接对打断后的片段进行高效富集，在连接酶的作用下，探针和目标片段进行环化，环化后复合体在一条带有标识(用于区分不同的样本)引物作用下，进行滚环扩增，可以迅速得到直接用于上机测序的大量文库。此方法最大的优点在于可以快速、最大限度地增加库容量，减少测序数据中的冗余。在本发明的一个实施方案中，1)设计特异性序列a-e：序列a，长度30-40可以来自测序引物；序列b，长度30-40；序列c，长度20-30；多个序列d，长度6-10，为标签序列，不同序列代表不同样本；序列e，长度20-30；序列a和序列b的3’端有多个碱基相同，优选有12个互补碱基。2)设计指定区域内的探针序列：根据目标区域，设计dna探针，此探针的结构包括3部分：5’端部分为b序列3’端部分反向互补序列，长度优选为20bp，3’端部分为序列a的3’端部分，长度优选为20bp，中间部分为与打断后的目标片段互补的序列，长度优选为100bp，探针的总长度优选为140bp，探针序列是5’端与3’端有多个碱基反向互补，优选有12个碱基反向互补；3)合成滚环扩增引物和去掉两条探针自连的引物滚环扩增引物：序列c+序列d+序列b去掉两条探针自连的引物：b序列后10个+a序列反向互补序列前10个。4)合成两条引物引物f：序列e+序列a；引物r：滚环扩增引物。在一个实施方案中，序列a可以来自测序引物，例如是测序引物read1序列：acactctttccctacacgacgctcttccgatct。序列b可以来自测序引物，例如是测序引物read2：gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc。序列c可以来自测序接头，例如是测序接头p7：caagcagaagacggcatacgagat。序列d为标签序列，不同序列代表不同样本，例如aatgatga；序列e可以来自测序接头，例如是测序接头p5：aatgatacggcgaccaccgagatct。在一个具体实施方案中，序列a：acactctttccctacacgacgctcttccgatct；序列b：gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc；序列c：caagcagaagacggcatacgagat；序列d：aatgatga；序列e：aatgatacggcgaccaccgagatct。1)探针序列：序列b互补序列5’端20nt(seqidno.1)+互补靶序列+序列a的3’端20nt(seqidno.2)；2)seqidno.3：序列c+序列d+序列b；seqidno.4：seqidno.1互补序列3’端10个+seqidno.2互补序列5’端10个；tcgcagcacaagacgtgtgc-3’；3)引物f(seqidno.5)：序列e+序列a；引物r(seqidno.6)：即seqidno.3。在一个实施方案中，合成一系列带有相同部分接头序列的探针，探针序列结构如下：gatcggaagagcacacgtct(20bp)(seqidno.1)+探针与目标区域杂交部分(100bp)+acacgacgctcttccgatct(20bp)(seqidno.2)(探针序列)gatcggaagagcacacgtct序列为read2测序引物互补的3’端部分反向互补序列，acacgacgctcttccgatct为readl测序引物的3’端部分。这两条序列其中有12个碱基反向互补(gctcttccgatc-gatcggaagagc)。在一个实施方案中，合成一条带有标识序列(index序列)的引物用于滚环扩增：caagcagaagacggcatacgagatcaatgatgagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc(seqidno.3)，caagcagaagacggcatacgagat为p7序列，用于把文库固定到芯片上，aatgatga为标识序列，标识序列用于合成识别不同样本的，不同样本用不同的特异性序列，gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc序列为read2测序序列。在一个实施方案中，合成去掉两条探针自连的引物：设计一条引物，这条引物横跨read2和redal测序引物的部分序列，并且在3’端带有阻断基团，目的是阻止引物的延伸，从而有效地阻止了带有探针序列文库的消耗。c3间臂作为一种用来封闭3’引物延伸的磷酸二酯键，比单独的磷酸基团封闭更稳定，c3间臂修饰的引物在4℃，可以稳定储存8周以上，虽然3’双脱氧核苷酸也可以起到同样程度的封闭的效果，但是合成成本昂贵。tcttccgatcagatcggaag-3’-spacerc3(seqidno.4)，tcttccgatc此序列为与gatcggaagagcacacgtct前10个碱基反向互补，agatcggaag此序列为acacgacgctcttccgatct反向互补序列的前10个碱基。c3间臂(spacerc3)为封闭基团，用于阻止探针自连后的扩增。c3间臂主要用于模仿核糖的3′和5′羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。3′-c3间臂用于引进一个3′间臂从而阻止3′端外切酶和3′端聚合酶发挥作用，由序列合成公司提供。在一个实施方案中，产生文库大小在220-320bp的一对引物：f：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct(seqidno.5)：aatgatacggcgaccaccgagatct(seqidno.8)为p5序列，acactctttccctacacgacgctcttccgatct为测序引物read1序列r：caagcagaagacggcatacgagatcaatgatgagtgactggagttcagacgtgtgctc(seqidno.6)：caagcagaagacggcatacgagat(seqidno.7)序列为p7序列，aatgatga为与标识互补序列，用于合成识别不同样本的标识序列，gtgactggagttcagacgtgtgctc为read2测序引物序列的一部分。样品打断：对提取出来的基因组dna进行打断，片段大小范围为150bp-200bp。并通过qseq100对打断后的片段大小进行质检，同时通过qbit检测打断后样品的浓度。捕获建库：打断后的dna和探针分子数按照不同的比例进行混合，反应条件为95℃变性5min，然后进行退火，反应条件为每8s下降0.1℃，降至25℃，时间为90min，这时大部分的目标片段与有部分或者全部配对探针的碱基之间可以形成waston-crick键，此时加入circligasetmiissdnaligase，探针与目标片段发生环化。然后对环化后的产物进行纯化，纯化完之后通过一条带有标识序列的引物，在phi29聚合酶的作用下进行20-30min滚环扩增，同时在此过程中，加入的tcgcagcacaagacgtgtgc-3’-spacerc3序列会结合在两条探针相互成环的部分，阻止了以探针作为模板的扩增，通过磁珠筛选，然后对筛选后的产物中加入dna聚合酶、相应buffer、f和r成对引物进行8轮常规pcr扩增。磁珠对pcr扩增之后的产物进行纯化，纯化后的产物可以直接用于上机测序。实施例：将提取出来的基因组dna进行3轮打断，每轮结束后将样品置于振荡器上充分混匀，并进行短暂离心后，再进行下一轮打断。取1ul样品进行毛细管电泳检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。退火：反应条件为95℃变性5min，然后进行退火，反应条件为每8s下降0.1℃，降至25℃，时间为90min。为了在连接反应中形成更多的滚环复合体，对打断后的dna分子数与探针分子数的比例进行设计，比例如下：分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶55，1∶60，1∶65，1∶70，1∶75，1∶80，1∶85，1∶90，1∶95，1∶100，同时保证打断后dna与探针的总数为10pmol。1.连接反应：探针与打断后dna的复合物20ulcircligaseii10xreactionbuffer4ul50mmmncl22ul5mbetaine8ulcircligaseiissdnaligase2ulh2o4ul总反应体积40ul反应条件为60℃，1小时。circligaseiissdnaligase在80℃，10min进行灭活。2.连接产物纯化(1)提前30min，将ampurexp磁珠从冰箱里取出来置于室温，使用前充分震荡混匀；(2)吸取96.35ul的ampurexp磁珠至消化产物中，用移液器吹打混匀10次，室温孵育10min(3)瞬时离心，将混有磁珠消化产物的ep管置于磁力架上，静置2min至液体澄清，弃掉上清；(4)继续保持ep管于磁力架上，加入500ul新鲜的80％的乙醇，静置1min后，弃掉上清；(5)重复(4)一次，尽量吸干ep管底残留液体，打开管盖，室温干燥3min；(6)将ep管从磁力架上取下来，加入20ulte进行洗脱，用移液器吹打混匀并在室温下进行溶解10min；(7)瞬时离心，将ep管置于磁力架上，静置2min至液体澄清，将18ul的上清液转移至一个新的ep管中。3.滚环扩增纯化后的连接产物18ulseqidno.3(100um)2ulseqidno.4(100um)1ul10xphi29dnapolymerasereactionbuffer5ul100xbsa0.5ul10xdntp5ulphi29dnapolymerase1ulh2o17.5ul总反应体积50ul反应条件为30℃，30min；phi29dnapolymerase在65℃，10min失活。4.滚环扩增产物纯化：(1)提前30min，将ampurexp磁珠从冰箱里取出来置于室温，使用前充分震荡混匀；(2)吸取25ul的ampurexp磁珠至消化产物中，用移液器吹打混匀10次，室温孵育10min；(3)瞬时离心，将混有磁珠消化产物的ep管置于磁力架上，静置2min至液体澄清，弃掉上清；(4)继续保持ep管于磁力架上，加入200ul新鲜的80％的乙醇，静置1min后，弃掉上清；(5)重复(4)一次，尽量吸干ep管底残留液体，打开管盖，室温干燥3min；(6)将ep管从磁力架上取下来，加入20ulte进行洗脱，移液器吹打混匀并在室温下进行溶解10min；(7)瞬时离心，将ep管置于磁力架上，静置2min至液体澄清，将18ul的上清液转移至另一个新的ep管中。(8)通过ssdnaqubit定量试剂盒对按照20种不同dna分子数与探针分子数比例进行纯化后滚环扩增产物进行定量，1∶5，1：10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶55，1∶60，1∶65，1∶70，1∶75，1∶80，1∶85，1∶90，1∶95，1∶100对应的浓度分别为：132ng/ul，90ng/ul，71ng/ul，60ng/ul，54ng/ul，52ng/ul，50ng/ul，51ng/ul，77ng/ul，71ng/ul，53ng/ul，45ng/ul，31ng/ul，10ng/ul，7ng/ul，5ng/ul，5ng/ul，4ng/ul，3ng/ul，3ng/ul，2ng/ul。(9)计算打断后dna转化效率：环化后总产量(ug)＝0.341*转化率*投入打断的dna总量(ng)滚环扩增总产量＝[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×打断后dna转化率(α)×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]/打断片段大小(180bp)打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]当dna分子数/探针分子数＝1∶5时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝132ng/ul×20ul×180/[99(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝7.8％当dna分子数/探针分子数＝1∶10时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝90ng/ul×20ul×180/[54(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝9.8％当dna分子数/探针分子数＝1∶15时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝71ng/ul×20ul×180/[37(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝11.2％当dna分子数/探针分子数＝1∶20时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝60ng/ul×20ul×180/[28(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝12.5％当dna分子数/探针分子数＝1∶25时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝54ng/ul×20ul×180/[23(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝13.7％当dna分子数/探针分子数＝1∶30时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝52ng/ul×20ul×180/[19.2(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝15.8％当dna分子数/探针分子数＝1∶35时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝50ng/ul×20ul×180/[16.5(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝17.6％当dna分子数/探针分子数＝1∶40时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝51ng/ul×20ul×180/[15(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝19.8％当dna分子数/探针分子数＝1∶45时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝45ng/ul×20ul×180/[12.9(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝27.3％当dna分子数/探针分子数＝1∶50时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝71ng/ul×20ul×180/[11.6(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝36％当dna分子数/探针分子数＝1∶55时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝53ng/ul×20ul×180/[10.6(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝29.2％当dna分子数/探针分子数＝1∶60时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝51ng/ul×20ul×180/[9.7(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝27.3％当dna分子数/探针分子数＝1∶65时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝31ng/ul×20ul×180/[9(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝20.3％当dna分子数/探针分子数＝1∶70时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝10ng/ul×20ul×180/[8.4(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝7.2％当dna分子数/探针分子数＝1∶75时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝7ng/ul×20ul×180/[7.8(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝5.8％当dna分子数/探针分子数＝1∶80时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝5ng/ul×20ul×180/[7.3(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝3.7％当dna分子数/探针分子数＝1∶85时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝5ng/ul×20ul×180/[6.9(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝3.5％当dna分子数/探针分子数＝1：90时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝3ng/ul×20ul×180/[6.5(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝3.2％当dna分子数/探针分子数＝1∶95时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝3ng/ul×20ul×180/[6.2(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝2.8％当dna分子数/探针分子数＝1∶100时打断后dna转化率(α)＝滚环扩增总产量×打断片段大小(180bp)/[投入打断的dna总量(ng)×10-3×3030×第一次纯化效率×第二次纯化效率×滚环扩增倍数(300)×滚环碱基数(320bp)×3.3×10-4]＝2ng/ul×20ul×180/[5.8(ng)×10-3×3030×80％×80％×300×320bp×3.3×10-4]＝1.8％由以上结果，当转化率对应的dna分子数/探针分子数＝1∶50时，打断后dna转化率最高，为36％。5.文库制备：纯化后的文库扩增产物20ulkapa25005xhififidwithmybuffer8ul10mmdntp1.2ulseqidno.51ulseqidno.61ulke2502hotstart1ul去核酸酶水7.8ul总反应体积40ul反应条件：(1)pcr结束后向样品加入45μlmagpurea3xp磁珠，用移液器轻轻吸打6次混匀，室温孵育5min。(2)把pcr管转移至磁力架上静置3min；(3)移除上清，pcr管继续置于磁力架上，加入200μl80％无水乙醇，静置30s；(4)重复步骤(3)，可用10ul移液器移除底部残留酒精；(5)室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发；(6)加入25ulnuclease-freewater，将pcr管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min；(7)将pcr管置于磁力架上2min；(8)用移液器移取23μl上清液至新的pcr管中。(9)取1μl文库使用qubitdsdnahsassaykit进行定量，记录文库浓度；(10)取1ul样品稀释至2ng/ul使用agilent2100bioanalyzersystem(highsensitivitydnakit)进行文库片段长度测定，文库长度约在220-320bp之间。实验数据结果：通过对购买标准品进行稀释后得到0.001突变频率进行建库，本实验分为实验和对照2个组，实验组为快速捕获建库方法，对照组为现有建库方法，每组建库的样本数为20个，每个样本均包含8个频率为千分之一的标准位点。分别对这40个样本进行建库捕获、测序及数据分析，计算40个样本中每个突变位点在不同方法下的检出率。最后发现在快速捕获建库方法下，突变的检出率提升了5％-35％不等，尤其对点突变的检出率超过80％。序列表<110>艾吉泰康生物科技（北京）有限公司<120>一种快速捕获建库的方法<130>cf180145s<141>2018-04-03<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>1gatcggaagagcacacgtct20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>2acacgacgctcttccgatct20<210>3<211>66<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>3caagcagaagacggcatacgagatcaatgatgagtgactggagttcagacgtgtgctctt60ccgatc66<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>4tcttccgatcagatcggaag20<210>5<211>58<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>5aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>6<211>58<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>6caagcagaagacggcatacgagatcaatgatgagtgactggagttcagacgtgtgctc58<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>7caagcagaagacggcatacgagat24<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列(syntheticsequeces)<400>8aatgatacggcgaccaccgagatct25当前第1页12