本发明涉及微生物和连作障碍修复领域，具体涉及一种用于缓解瓜类作物连作障碍的微生物菌剂及其应用。
背景技术：
瓜类作物含有人类营养所必需的各种成分，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、ca、p、fe、胡萝卜素、微生素等。许多文献和实物考证发现中国有着3000多年栽培瓜类作物的历史，是世界上最早栽培瓜类作物的国家之一。
近年来，瓜农盲目追求高产，过量施用化肥和农药，导致土壤生态环境的破坏和农药残留超标。人口增加、城市发展，导致耕地面积逐步减少，由此设施农业得到迅速发展，为作物提供了适宜生长环境。然而设施农业耕地轮作倒茬困难的特点，也为土壤病原微生物及害虫创造了有利的繁衍条件，加大了连作障碍发生的可能性。土传病害是连作障碍发生的重要原因之一，由于土传病害发生在作物根部，一旦作物地上部分表现出症状，则作物病害发生已较为严重，很难得到控制，为病害的防治带来很大难度。作物轻者产量降低，品质变劣，重者绝收。连作障碍严重制约了农业的可持续发展和粮食安全，还威胁着消费者的健康，因此，连作障碍成为设施农业生产亟需解决的瓶颈问题之一。
大量研究发现自毒作用是产生瓜类作物连作障碍的重要原因，连续种植导致土壤生态环境发生改变，植物病残体及根系分泌物与病原微生物的代谢物对植物生长具有毒害作用，影响种子萌发、植株生长、细胞分裂、病原菌活性和土壤微生物结构，从而引发自毒作用，导致连作障碍的产生。采用棉隆等化学药剂消毒灭菌和熏蒸土壤，可防治土传病害、线虫和杂草，已在世界范围广泛应用。研究证明，采用土壤消毒方法即可消除障碍或减轻障碍。棉隆熏蒸处理黄瓜、瓜类作物大棚土壤，后茬黄瓜或瓜类作物枯萎病发病率显著降低。虽然化学药剂可以减低枯萎病的发生，但对于瓜类作物根际的自毒物质并没有降解作用，长期采用杀菌剂和化肥进行土壤治理，可以导致土壤板结酸化、养分失衡、次生盐渍化等问题，而通过添加有益微生物或拮抗菌等手段可以有效的防治由自毒作用和根系土传病害等引起的连作障碍的发生。目前应用于瓜类作物连作障碍和自毒作用治理的益生菌比较少，严重制约了瓜类作物连作障碍的治理和瓜类作物产业的可持续发展。
以下是申请人检索的与本申请相关的参考文献
1.程莹，白寿发，庄敬华等.2011.甜瓜残茬腐解物对镰孢枯萎病的助长作用.中国农学通报,27(8):217-221.
2.李勇,龙期良,丁万隆等.2014.微生物降解对人参自毒作用的缓解效应.中国中药杂志,39(15):2868-2872.
3.李夏,周宝利,陈绍莉,蔺姗姗.2009.茄子自毒物质对辣椒种子萌发及枯萎菌的化感效应.生态学报,29(2):960-965.
4.赵亚慧，袁云云，杜海岩等.2015.花生化感物质降解菌发酵参数的优化.花生学报，44(4)31-36.
5.刘昭军,王德国,李铁等.2007.野生大豆根际微生物的分离及其缓解大豆连作障碍的研究.26(2)176-180.
技术实现要素：
为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于缓解瓜类作物连作障碍的微生物菌剂及其应用，用于降解土壤内残留的酚酸物质，解决瓜类作物连作障碍问题，起到促进植株生长和降解土壤酚酸物质的有害作用的目的。
本发明的另一个目的在于，提供一种缓解瓜类作物连作障碍的微生物菌剂的制备方法，由一种瓜类作物内生细菌伯克霍尔德菌(burkholderiaphytofirmans)和矿质营养元素通过优化配比混合而成，其目的是降解土壤内酚酸物质，增强植株的抗逆能力，防治瓜类作物枯萎病，降低土壤内酚酸物质的产生及危害。
本发明的目的是通过以下技术解决方案实现的：一种用于缓解瓜类作物连作障碍的微生物菌剂及其应用，其技术要点是：
一种用于缓解瓜类作物连作障碍的微生物菌株：该菌株的分类命名为伯克霍尔德菌(burkholderiaphytofirmans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.15326，菌株编号为20180101辽ck1，保藏日期为2018年1月29日。
该菌株的菌落及菌体特征为：该自毒物质降解菌在na培养基(酵母浸粉1g；牛肉膏3g；蛋白胨5g；蔗糖10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；121℃灭菌30min)上培养48h后菌落成白、圆形、表面光滑、隆起、边缘整齐、直径2～4mm。菌体杆状，丛生鞭毛，革兰氏染色阴性，不产芽孢。
该菌株生理生化特征为：氧化酶试验阴性或阳性、接触酶试验阴性或阳性、淀粉水解试验阴性、明胶液化试验阳性，硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、丙二酸盐利用试验阳性、h2s试验阳性、甲基红试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、蔗糖利用试验阳性、麦芽糖利用试验阴性。
伯克霍尔德菌菌株的最适宜培养基为lb培养基，配方包括胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠(nacl)10g/l，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天。
该菌剂可用于制备微生物菌剂；菌液的浓度为2.5-3.5×108cfu/ml。
菌剂的使用方法：在瓜类作物的移栽期采用穴施和灌根的施用方法，每颗苗菌剂用量为250ml。
作为实施例的优选方式，所述微生物菌剂加入矿质营养元素，包括磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钙、钼酸、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌，有效成分为：
本发明的有益效果：该微生物菌剂为瓜类作物根际土壤分离菌，在瓜类作物植株的根际定殖能力好并且安全可靠，对连作瓜类作物土壤中自毒物质具有良好的降解作用，明显改善了土壤理化性质，同时对瓜类作物植株的抗逆能力具有明显的促进作用，提高瓜类作物的产量和果实品质；微生物菌剂制备方法简单，配方合理，可以用于瓜类作物连作障碍的治理。
具体实施方式
1.材料和方法
1.1用于分离伯克霍尔德菌的培养基为无机盐培养基，配方包括mgso4·7h2o0.2g/l，cacl2·2h2o0.02g/l，fecl30.05g/l，kh2po41.0g/l，k2hpo41.0g/l，nh4no31.0g/l，胆固醇0.3g/l，琼脂17g/l分别以处理浓度为200μg·ml-1的对羟基苯甲酸、苯甲酸和肉桂酸作为唯一碳源，调ph值至中性。
1.2用于分离伯克霍尔德菌的方法：
称取瓜类作物根际土壤10g打磨后放入250ml的三角瓶中，加入90ml无菌水摇匀，在摇床上以120r·min-1摇30min，使土样充分混匀，配成10-1倍稀释液；用移液枪吸取1ml10-1稀释液移入装有9ml无菌水的灭菌试管中，配成10-2倍稀释液；再用移液枪吸取1ml10-2稀释液移入装有9ml无菌水的灭菌试管中，最终配成10-3倍稀释液。将无机盐培养基熔化，加入链霉素倒入灭菌培养皿中，待培养基冷却完全，用移液枪吸取0.1ml10-3倍稀释液于培养皿中，用无菌刮铲将培养液涂匀，每个处理重复3次，28℃温箱中培养48h，得到伯克霍尔德菌菌株。
分类命名为伯克霍尔德菌(burkholderiaphytofirmans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.15326，菌株编号为20180101辽ck1，保藏日期为2018年1月29日。
1.3制备伯克霍尔德菌菌剂：用于培养伯克霍尔德菌菌株(菌株编号为20180101辽ck1)的适宜培养基和lb培养基，配方包括胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠(nacl)10g/l，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天，得到菌悬液。
1.4降解瓜类作物连作障碍的微生物菌剂的制备及应用：将所得伯克霍尔德菌菌悬液(浓度为3.5×108cfu/ml)加入矿质营养元素，包括磷酸二氢钾100-150mg/l、硫酸镁200-500mg/l、硫酸钙500-900mg/l、钼酸0.5-1.0mg/l、硫酸锰15-30mg/l、硫酸亚铁3-5mg/l、硫酸锌5-10mg/l；100g连作土与微生物菌剂50ml混合，25℃保湿条件下培养30天；100g连作土与50ml无菌水混合作空白对照；每个处理三次重复。
1.5微生物菌剂对瓜类作物根际土壤中的酚酸物质的降解作用检测方法：
(1)取25g的供试土壤置于75ml的离心管中，向土壤中添加25ml的1mol·l-1的naoh溶液，用漩涡震荡仪混匀后静置24h，次日经翻转摇匀仪混匀1h，超声波振荡器震荡30min，离心后分离上清液，采用12mol·l-1的盐酸调整土壤溶液ph值到2.5，静置2h后离心除去胡敏酸，分离上清液4℃保存准备分析测定。
(2)酚酸类物质hplc分离和鉴定
标准溶液的配制：准确称量10mg苯甲酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、香豆酸、香兰素、苯甲基苄基质、水杨酸、邻苯二甲酸二乙酯(由上海sigma生物科技有限公司提供)分别置入100ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容至100ml，则该标准溶液每种酚酸的浓度100μg·ml-1。
(3)色谱条件：土壤中不同种类的酚酸的测定采用hplc法(agilentlc1100，美国)。样品进样前必须经过用0.22μm的微孔滤膜过滤去除溶液中存在的杂质，色谱分离柱为sb-c18(agilent4.6mm×250mm)，设流速1ml·min-1，柱温25℃，样品检测波长280nm，每次进样量均为20μl，流动相a：甲醇(色谱级)和流动相b：ph＝2.8的乙酸水溶液(色谱级)，样品分离通过梯度洗脱的方法达到分离和缩短酚酸类物质保留时间的目的。洗脱条件b：70％(0min)→50％(15min)→30％(16min)→0％(30min)→end(30min)。采用保留时间进行定性，采用峰面积外标法进行定量。
(4)数据处理及统计分析
每试验重复3次，使用spss17.0对数据进行统计分析，各处理间显著性差异分析使用duncan法进行分析。
土壤中酚酸类物质含量r(mg·kg-1)的计算公式如下：r(mg·kg-1)＝
s样×v样×c标/s样×m(r-样品中某物质酚酸含量；s样-样品峰面积；v样-样品定容体积，ml；c标-标准溶液浓度，mg·l-1；s标-标准溶液峰面积；m-样品重量，g。)
降解率的计算公式：降解率＝对照组酚酸含量-处理组酚酸含量/对照组酚酸含量×100
1.6微生物菌剂防治甜瓜枯萎病的田间试验
供试甜瓜品种：特大超早糖王(黑龙江景丰高新技术开发有限公司)。
试验地点：沈阳农业大学试验基地。
甜瓜种植前一个月进行整地施肥，3-4月进行定植，定植穴施深15厘米，瓜苗入坑后使瓜土坨上距畦面2-3厘米，周围用细土围好，定植水中加入，微生物菌剂灌根处理，菌液的浓度为3.5×108cfu/ml。
设不采用微生物菌剂灌根处理为对照，第一茬、第二茬甜瓜开花结果期调查枯萎病发病情况，采收期调查产量，即待田间甜瓜坐果成熟后，对各个处理条件下的甜瓜果实进行称重并记录数据，计算不同处理条件下的甜瓜产量。
发病率(％)＝发病总株数/总株数×100
病情指数(％)＝∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高级代表值×100
2结果与分析
微生物菌剂对甜瓜连作土壤中的酚酸物质的降解作用结果表明，该菌剂对甜瓜分泌物中的主要酚酸具有优异的降解作用，其中对肉桂酸、香豆酸、香草酸的降解最佳(见表1)。
表1微生物菌剂对甜瓜连作土壤中的酚酸物质的降解作用
大田试验研究结果表明，外源施加微生物菌剂可利于增强植株的生长和产量的提高，可利于增强植株的生长和产量的提高，降低甜瓜枯萎病的发生(表2)。
表2微生物菌剂对甜瓜株高、产量和发病率的作用