本发明涉及一种催化效率提高的d,d-羧肽酶daca突变体及其制备方法，属于酶工程领域。
背景技术：
大肠杆菌(escherichiacoli)是最广泛使用的用于重组蛋白质生产的细菌种类之一，它具有诸多优点(如翻译后修饰-二硫键形成等)。但在大肠杆菌中，大多数蛋白质被转运到细胞的周质空间而不能直接到达胞外，这容易带来诸多问题(如蛋白质生产不连续等)。肽聚糖作为细胞壁的主要成分，有助于维持细胞结构的鲁棒性。通过破坏细胞周围的肽聚糖结构可增强大分子的细胞外生产水平。d,d-羧肽酶daca可从肽聚糖侧链切除末端d-丙氨酸残基，其对于合成肽聚糖网络及维持其结构稳定具有重要作用。
具有高催化效率的d,d-羧肽酶daca可高效调控肽聚糖网络合成，可应用于代谢改造e.coli提高其蛋白胞外分泌水平等方面。定点突变和定向进化是提高酶催化效率的两种主要手段。定向进化虽然不需要准确的酶分子结构信息，但是需要建立一种能够从大量的突变株中快速简便的筛选到优势菌株的方法。而定点突变，与定向进化相比，是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶催化效率的方法。
技术实现要素：
本发明基于已得到的d,d-羧肽酶daca在e.coli中的表达平台，利用定点突变技术，对d,d-羧肽酶daca进行分子改造，以得到更适合代谢改造e.coli提高其蛋白胞外分泌水平等方面应用的催化效率提高的d,d-羧肽酶daca突变体。
本发明提供了一种催化效率提高的d,d-羧肽酶daca突变体，是通过定点突变方法在d,d-羧肽酶daca酶催化结构域内(口袋区域)进行氨基酸替换，获得了催化效率提高的d,d-羧肽酶daca突变体。
所述d,d-羧肽酶daca突变体是以seqidno.1为出发序列，在第113位氨基酸位置处做如下替换：赖氨酸替换成精氨酸、甘氨酸或组氨酸。
本发明还提供一种制备所述催化效率提高的d,d-羧肽酶daca突变体的方法，具体步骤如下：
1)将编码大肠杆菌d,d-羧肽酶daca的基因(seqidno.2)，通过pcr方法克隆到质粒pet-28a(+)中，构建重组质粒pet28a-daca(图1)；
2)设计突变引物，对d,d-羧肽酶daca基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有编码突变d,d-羧肽酶daca的基因序列的重组载体；
3)将突变后重组载体转化e.colibl21，诱导表达，获得d,d-羧肽酶daca突变体。
本发明提供的d,d-羧肽酶酶突变体催化效率显著提高，由原始菌株的6543.4s-1提高至9428.1s-1。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。所得d,d-羧肽酶daca突变体可用于催化park核苷酸生成d-丙氨酸、代谢改造微生物以提高其胞外蛋白分泌表达水平。
附图说明
图1：重组质粒pet28a-daca的图谱。
图2：d,d-羧肽酶daca的三级(3d)结构示意图。
图3：d,d-羧肽酶daca及其突变体的比酶活力。
具体实施方式
实施例1：d,d-羧肽酶daca催化效率定点突变分析与方法
通过swiss-model软件对源自大肠杆菌(escherichiacoli)的d,d-羧肽酶daca(seqidno.1)进行模拟，以获得的d,d-羧肽酶daca3d结构模型。选取位于“活性口袋”的关键氨基酸残基——赖氨酸，将其替换成精氨酸、甘氨酸或组氨酸。
根据e.colid,d-羧肽酶daca序列，以e.colibl21基因组为模板采用pcr方法克隆到质粒pet-28a(+)的酶切位点xhoⅰ、ecorⅰ之间，构建重组质粒pet28a-daca。
针对定点突变方式，设计相对应的定点突变引物(表1)。利用定点突变引物及重组质粒pet28a-daca，对d,d-羧肽酶daca进行定点突变。采用pcr酶，利用突变引物对重组质粒pet28a-daca进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得单点突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主bl21，在lb培养基中37℃培养8h，然后按1％(v/v)的接种量接种到tb培养基中，37℃培养至od600＝0.8，加入终浓度为1mmol/l异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，25℃诱导表达，进行蛋白纯化后获得单点突变后的重组d,d-羧肽酶daca。
表1d,d-羧肽酶daca突变引物序列
实施例2：d,d-羧肽酶daca酶活力测定及分析方法
(1)d-丙氨酸标准曲线的制作：配制0-60mm不同浓度的d-丙氨酸溶液。加5μl邻联茴香胺溶液，70μl酶和辅酶(39:19:10:2)的混合物，37℃反应5min。立即加入400μl甲醇/水(1:1)混合物，37℃反应2min，测定460nm下的吸光光度值。以d-丙氨酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
(2)反应体系包括：15μl底物park核苷酸类似物(na,ne-diacetyl-lys-d-ala-d-ala)、3μltris-hcl缓冲液(ph7.5)和12μl酶溶液。混匀，37℃反应10min。加5μl邻联茴香胺，70μl酶和辅酶的混合物，37℃反应5min。立即加入400μl甲醇/水混合物，37℃反应2min，测定460nm下的吸光光度值。
(3)d,d-羧肽酶daca的催化效率测定
配制不同浓度的底物，采用(2)的方法，测定d,d-羧肽酶酶活。绘制酶活与底物浓度的线性关系，根据的斜率和截距得到该酶的催化效率kcat值。
(4)酶活力单位定义：在ph7.5，37℃条件下，1min催化底物产生1μmold-丙氨酸所需的酶量，为1个酶活力单位(u)。
实施例3：d,d-羧肽酶daca及其突变体催化效率的测定分析
通过对d,d-羧肽酶daca及其突变体的催化效率进行测定发现，突变体k113r和k113g的催化效率(表2)均有提高，但突变体k113h的催化效率有所下降。突变体k113r和k113g的催化效率常数kcat值分别由野生酶的6543.42s-1提高至8541.56s-1、9428.13s-1。其中突变体k113g的效果最显著，催化效率常数kcat值提高至原来的1.4倍。同时，突变体k113g的km值由野生酶的0.85mmol/l降低为0.66mmol/l，说明突变后酶与底物的结合能力增强。
表2d,d-羧肽酶daca突变体的动力学参数
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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