本发明属于动物卵母细胞体外培养领域，尤其涉及一种罗汉果提取物mogrosidev在促卵母细胞体外成熟方面的应用。
背景技术：
卵母细胞体外成熟是用于体外受精、克隆保种及转基因动物生产的一项重要技术，猪卵母细胞质量对体外受精及激活后胚胎发育影响重大。近几十年，国内外猪卵母细胞体外培养技术有了长足发展，但是成熟卵母细胞体外发育能力较体内卵母细胞仍然低很多，这使得克隆效率以及体外受精效率受限制于优质卵母细胞的缺乏。近年来，猪卵母细胞体外成熟技术有较大的进步，如中国专利“一种简单、经济、高效的猪卵母细胞体外成熟方法”(专利号200910185795.7，公开日2010-05-19)和中国专利申请“一种提高猪卵母细胞体外成熟率的培养液及其应用”(专利申请号201710305057.6，公开日2017-08-29)。
卵母细胞体外成熟受许多因素影响，卵子种类、培养条件和培养液成分，其中培养液成分直接影响卵母细胞发育。卵母细胞成熟过程中，培养环境对卵母细胞产生重要影响，例如氧化应激和脂滴含量，细胞内活性氧自由基离子产生过多，氧化应激水平变化使卵母细胞发育异常，因此维持卵母细胞氧化应激水平对卵母细胞体外成熟尤其重要。脂滴大量分布在卵母细胞胞质中，由脂肪酶分解成不同长度的脂肪酸，进入线粒体进行β氧化，维持卵母细胞形态和正常发育。
mogrosidev提取自中国广西特种植物罗汉果，属于皂甙的一种，较蔗糖甜度高。近几年来科学家对罗汉果的研究逐渐深入，罗汉果作为饮品置于茶叶中，其提取物具有抗氧化、抗炎、抗癌的作用。最近有研究报道，20μm的罗汉果皂甙mogrol可促进脂肪组织中脂肪的分解，降低脂滴密度。罗汉果提取物的主要成分mogrosidev可降低细胞中氧化应激的水平，促进细胞的生长。然而，这些只是一些机制研究以及细胞中的研究状况，对于mogrosidev能否促进减数分裂，提高卵母细胞发育效率，并用于孤雌激活尚无报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种罗汉果提取物mogrosidev在促卵母细胞体外成熟方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
罗汉果提取物mogrosidev在促卵母细胞体外成熟方面的应用。
卵母细胞为猪卵母细胞。
猪卵母细胞所处的未成熟时期为germinalvesicle期。
提高猪卵母细胞体外成熟率的培养液，含有罗汉果提取物mogrosidev。
上述培养液，以常规培养液为基础添加罗汉果提取物mogrosidev。
上述培养液，以常规培养液为基础添加罗汉果提取物mogrosidev(罗汉果甜苷v)，pva(聚乙烯醇)，d-glucose(葡萄糖)，sodiumpyruvate(丙酮酸钠)，cysteine(半胱氨酸)，penicilling(青霉素钾)，streptomycin(链霉素)，egf(表皮生长因子)，pff(猪卵泡液)，follicle-stimulatinghormone(促卵泡素fsh)和luteinizinghormone(促黄体素lh)。
上述培养液，常规培养液中罗汉果提取物mogrosidev，pva，d-glucose，sodiumpyruvate，cysteine，penicilling，streptomycin，egf，pff，follicle-stimulatinghormone和luteinizinghormone的浓度分别为20μm，0.1％，3.05mm，0.91mm，0.57mm，75μg/ml，50μg/ml，10ng/ml，10％，0.5μg/ml和0.5μg/ml；常规培养液为tcm-199。
猪卵母细胞体外成熟的培养方法，使用含有罗汉果提取物mogrosidev的猪卵母细胞体外成熟培养液。
培养液以tcm-199为基础添加了罗汉果提取物mogrosidev，pva，d-glucose，sodiumpyruvate，cysteine，penicilling，streptomycin，egf，pff，follicle-stimulatinghormone和luteinizinghormone，其浓度分别为20μm，0.1％，3.05mm，0.91mm，0.57mm，75μg/ml，50μg/ml，10ng/ml，10％，0.5μg/ml和0.5μg/ml。
上述猪卵母细胞体外成熟的培养方法，按以下步骤操作进行：
<1>将germinalvesicle期的卵丘-卵母细胞复合体放置于预热的猪卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于c02体积浓度为5％，38.5℃的环境中培养40-44h；
<2>卵丘卵母细胞成熟后，用0.1％透明质酸酶将卵丘细胞去除，即可获得成熟的卵母细胞。
针对目前卵母细胞体外成熟技术存在的问题，发明人利用当地罗汉果提取物mogrosidev进行研究，发现罗汉果提取物mogrosidev具有良好的促卵母细胞体外成熟的作用。据此，发明人还建立了相对完善的培养体系——培养液和培养方法。该培养液是以常规培养液为基础添加罗汉果提取物mogrosidev。研究表明，使用该培养液可以显著地提高猪卵子体外成熟质量，卵母细胞体外成熟率从79.4％提高到87.4％，并且对卵子发育潜能具有促进作用。因此，本发明极大地提高了卵母细胞体外成熟率，解决了目前成熟效率低、培养周期长、不利于大规模生产的问题，采用本发明能为体细胞核移植、体外受精、体细胞克隆提供更多的优质卵母细胞。
附图说明
图1是猪卵母细胞体外成熟率对比图。
图2是猪孤雌激活胚胎发育分裂率和囊胚率对比图。
图中：con为对照组，20um为实验组；a为分裂率，b为囊胚率；*表示差异显著，**表示差异极显著。
具体实施方式
一、获取卵母细胞
将完整的母猪卵巢存放于盛装有未添加抗生素的生理盐水中的容器内保存，容器内的温度为30-34℃，运输温度以此为最合适。在抽卵及捡卵过程中使用的卵母细胞清洗液含有双抗，保证从运输，采集到培养为卵母细胞提供最合适的环境。将所有的卵母细胞放置于卵母细胞清洗液中收集好之后，准备进行下一步培养。其中，卵母细胞清洗液成分如表1所示，na0h调ph后，通过0.22μm的滤器过滤，4℃保存备用。
表1卵母细胞清洗液成分
二、卵母细胞体外成熟培养
gv期卵母细胞从卵巢中获取出来之后，放置于卵母细胞清洗液筛选合适的卵丘-卵母细胞用于卵母细胞体外成熟，卵母细胞经过体外成熟培养液清洗3遍之后，除去残余的卵母细胞清洗液，将所有的卵母细胞放置于预热的体外成熟培养液中，并在38.5℃，5％co2环境中培养40-44h。其中，体外成熟培养液成分如表2和表3所示，实验组培养液和对照组培养液使用naoh调ph后，通过0.22μm的滤器过滤，4℃保存备用。使用前，体外成熟培养液需提前置于在38.5℃，5％co2环境中平衡6h以上。
本发明所用罗汉果提取物mogrosidev纯度为99.26％-hplc，由成都普瑞法科技开发有限公司提供。
三、激活卵母细胞
卵母细胞经过40-44h成熟培养之后，用0.1％(w/v)的透明质酸酶消化卵母细胞，在体式显微镜下观察卵母细胞，分别从对照组和实验组培养的细胞中挑选出含有第一极体的成熟卵母细胞，放置于pzm-3胚胎培养液中，随后进行电激活，激活参数为1.2kv/cm，2dc以及30μs。将激活后的卵母细胞放置于预先平衡好的pzm-3胚胎培养液中，并放在38.5℃，5％co2环境中培养。分别在48h和168h检查分裂率和囊胚率。其中，pzm-3胚胎培养液成分如表4所示。pzm-3胚胎培养液使用naoh调ph后，通过0.22μm的滤器过滤，4℃保存备用。使用前，pzm-3胚胎培养液需在38.5℃，5％co2环境中平衡3h以上。
表4pzm-3胚胎培养液成分
四、实验结果
如图1和表5所示，含20μmmogrosidev的卵母细胞体外成熟培养液可明显的提高卵母细胞体外成熟率，促进卵子减数分裂，将成熟率从79.4％提高到87.4％。
表5猪卵母细胞体外成熟
注：同列数字上标不同字母表示差异显著(p＜0.05)；对照组：未添加mogrosidev的培养液培养的卵母细胞；实验组：添加20μmmogrosidev培养液培养的卵母细胞；实验重复3次以上；mean±sem：平均数±标准误。
如图2所示，经过实验组培养液培养的卵母细胞以及对照组培养液培养的卵母细胞进行孤雌激活后，培养至囊胚，48h后检查分裂率，144h后检查囊胚率，发现含有20μmmogrosidev的卵母细胞体外成熟培养液培养的细胞与对照组培养液培养的细胞相比，可促进后续孤雌激活胚胎的分裂率(81.5±1.0％vs89.4±1.5％)以及囊胚率(30.3±4.5％vs44.5±2.4％)。