本发明涉及微生态制剂领域，更具体的，涉及光合细菌培养菌剂及其制备方法。
背景技术：
光合细菌(psb)是地球上出现最早的，能够进行光合作用的一类原核生物总称，广泛分布于海洋、湖泊、河流、活性污泥及农田土壤中。光合细菌在农业生产及水质改良领域有着广泛的应用。研究表明，光合细菌自身生长代谢会产生丰富的b族维生素，类胡萝卜素，辅酶q10，叶酸等，因此，作为动物饲料添加剂具有非常高的营养价值。此外，光合细菌能有效去除废水中的有机物、以及氮、磷、硫化物，常被用在水产养殖领域来降低水塘中的氨氮、亚硝酸盐及有机物。
近年来，红螺菌科(rhodospirillaceae)假单胞菌属的光合细菌如沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、球形红假单胞菌，在水产养殖领域应用越来越广泛，其生产及加工方式也有较多的报道，尤其是针对光合细菌培养基配方优化、培养方式方法的研究报告很多。如专利200810222313.6公开了一种用水泥池子做容器，用透明塑料膜覆盖密封水泥池里的光合细菌液体培养物，在大于20度太阳光照射下培养，实现大规模产业化生产。专利201310147031.5公开了采用多次转种，多次培养，用乙酸调节ph，继续培养最终成为粘稠紫红色的光合细菌。上述专利的培养方式生产光合细菌都先需要20-25％左右的种子菌液，在大规模生产时先得通过多级培养获得大量种子菌液，操作起来较为繁琐，耗费时间较长。
目前，市场上常见的光合细菌产品，主要为光合细菌培养基和光合细菌菌液，培养时菌液的接种量均在20％左右。由于受到成本及冻干工艺技术的限制，目前还很少见到直接利用光合细菌冻干粉菌剂和培养基复配进行光合细菌生产的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种光合细菌培养菌剂。
本发明的又一目的是提供光合细菌培养菌剂制备方法。
本发明的又一目的是提供光合细菌培养菌剂在生产光合细菌中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种光合细菌培养菌剂，所述培养菌剂包括：
(3)光合细菌培养基；
(4)光合细菌冻干粉菌剂。
在另一优选例中，所述光合细菌选自下组：红螺菌科(rhodospirillaceae)假单胞菌属的光合细菌。
在另一优选例中，所述光合细菌选自下组：沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、球形红假单胞菌。
在另一优选例中，所述培养菌剂由光合细菌培养基和光合细菌冻干粉菌剂组成。
在另一优选例中，所述光合细菌培养菌剂中，
光合细菌培养基80wt％-99wt％；
光合细菌冻干粉菌剂1wt％-20wt％。
在另一优选例中，所述光合细菌培养菌剂中，
光合细菌培养基90wt％-99wt％；
光合细菌冻干粉菌剂1wt％-10wt％。
在另一优选例中，所述光合细菌培养菌剂中，
光合细菌培养基90wt％-98wt％；
光合细菌冻干粉菌剂2wt％-10wt％。
在另一优选例中，所述的光合细菌培养基含有原料：磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，乙酸钠，氯化钠，氯化钙，氯化镁，酵母浸粉，蛋白胨，氯化铵，硫酸亚铁，硫酸锰。
在另一优选例中，所述的光合细菌培养基各原料用量配比为：
磷酸二氢钾：10～50份，
磷酸氢二钾：5份，
乙酸钠：150～450份，
氯化钠：150份，
氯化钙：10份，
氯化镁：5份，
酵母浸粉：25-55份，
蛋白胨：10-25份，
氯化铵：60～280份；
硫酸亚铁：1份；
硫酸锰：1份；
其中份为重量份。
在另一优选例中，所述光合细菌冻干粉菌剂中，含有保护剂。
在另一优选例中，所述保护剂包括基础保护剂和增效保护剂。
在另一优选例中，所述保护剂选自下组：蔗糖、奶粉、甘露糖、海藻糖、麦芽糊精、抗坏血酸、谷氨酸钠、或其组合。
在另一优选例中，所述奶粉为脱脂奶粉。
在另一优选例中，所述保护剂含有：5-10wt％蔗糖，6-10wt％奶粉(例如脱脂奶粉)，0.5-2wt％麦芽糊精，0.01-0.1wt％抗坏血酸。
在另一优选例中，所述保护剂含有：8wt％蔗糖，6wt％奶粉(例如脱脂奶粉)，1wt％麦芽糊精，0.05wt％抗坏血酸。
在另一优选例中，所述的光合细菌培养基各原料用量配比为：
磷酸二氢钾：10～50份，
磷酸氢二钾：5份，
乙酸钠：150～450份，
氯化钠：150份，
氯化钙：10份，
氯化镁：5份，
酵母浸粉：25-55份，
蛋白胨：10-25份，
氯化铵：60～280份；
硫酸亚铁：1份；
硫酸锰：1份；
其中份为重量份；
所述光合细菌冻干粉菌剂中，含有保护剂；所述保护剂选自下组：蔗糖、奶粉、甘露糖、海藻糖、麦芽糊精、抗坏血酸、谷氨酸钠、或其组合。
在另一优选例中，所述奶粉为脱脂奶粉。
本发明的第二方面，提供了一种光合细菌培养菌剂的制备方法，包括步骤：
(1)提供光合细菌培养基和光合细菌冻干粉菌剂；
(2)将(1)中光合细菌培养基和光合细菌冻干粉菌剂混合均匀；
(3)任选地包装步骤。
在另一优选例中，所述光合细菌培养基制备方法为：将磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，乙酸钠，氯化钠，氯化钙，氯化镁，酵母浸粉，蛋白胨，氯化铵，硫酸亚铁，硫酸锰混合均匀制得光合细菌培养基。
在另一优选例中，所述光合细菌冻干粉菌剂的制备方法包括步骤：
(i)提供菌泥；
(ii)向(i)中的菌泥中加入保护剂，获得加有保护剂的菌泥；
(iii)向(ii)中的加有保护剂的菌泥中加入水(优选纯水)，获得菌泥-保护剂溶液；
(iv)对(iii)中菌泥-保护剂溶液进行预冻处理，获得冻干预冻菌；
(v)对(iv)中的冻干预冻菌进行冻干处理，获得光合细菌冻干粉菌剂。
在另一优选例中，所述收集菌泥为将培养好的光合细菌菌液用絮凝剂沉淀，收集菌泥。
在另一优选例中，所述保护剂含有：5-10wt％蔗糖，6-10wt％奶粉(例如脱脂奶粉)，0.5-2wt％麦芽糊精，0.01-0.1wt％抗坏血酸。
在另一优选例中，所述保护剂含有：8wt％蔗糖，6wt％奶粉(例如脱脂奶粉)，1wt％麦芽糊精，0.05wt％抗坏血酸。
在另一优选例中，所述步骤(iii)中，按照1:0.5～1的重量比例加入纯水。
在另一优选例中，所述步骤(iv)中，预冻处理温度为-65度。
在另一优选例中，所述步骤(iv)中，预冻处理时间为2-24小时；较佳地为5-20h；更佳的为10h。
在另一优选例中，所述步骤(v)中，冻干处理过程中，设置冻干机真空度0.01-0.05mba，较佳的为0.02mba。
在另一优选例中，所述步骤(v)中，冻干处理时间为20-50小时，较佳的为30小时。
本发明的第三方面，提供了本发明的第一方面所述的光合细菌培养菌剂在生产光合细菌中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种生产光合细菌的方法，使用本发明的第一方面所述的光合细菌培养菌剂。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)提供容器；
(b)将本发明的第一方面所述的光合细菌培养菌剂溶解于所述容器中,形成溶液1；
(c)对(b)中的溶液1进行培养。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，所述培养在厌氧环境下进行。
在另一优选例中，所述厌氧环境通过将所述步骤(b)中的溶液1置于密闭环境下进行。
在另一优选例中，所述厌氧环境通过在所述步骤(b)中的溶液1表面覆盖一层或多层膜实现。
在另一优选例中，所述一层或多层膜为透明pe塑料膜。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，所述培养在25-40温度下进行，优选25-35度，更优选30度。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，所述培养在光照下进行。
在另一优选例中，所述光照强度为1000-5000勒克斯，优选2000-4000勒克斯，更优选3000勒克斯。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为固体培养基分离的纯种沼泽红假单胞菌。
图2为光合细菌沼泽红假单胞菌冻干粉菌剂。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，将经优化的光合细菌培养基和采用优化的工艺(包括提供菌泥、在菌泥中加入保护剂，加入纯水后进行预冻处理，然后进行冻干处理)制备的光合细菌冻干粉菌剂(其中含有保护剂，例如蔗糖、奶粉、麦芽糊精、抗坏血酸)按照一定的比例混合复配，制备光合细菌培养菌剂。使用时，直接加入一定量的水，通过一批培养(例如在厌氧环境下培养)即可获得大规模的光合细菌菌液，无需在额外接入种子液，操作方便，使用简单，培养所需周期短。在此基础上，完成了本发明。
术语
光合细菌培养基
光合细菌培养基是用来培养光合细菌的营养成分，根据光合细菌的生长所必须的碳源、氮源及无机盐等，通过培养基成分优化确定最终的光合细菌培养基。
典型地，本发明培养基成分包括：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙酸钠、氯化钠、氯化钙、氯化镁、酵母浸粉、蛋白胨、氯化铵、硫酸亚铁、硫酸锰。
保护剂
保护剂是光合细菌冻干粉制备时与菌泥混合，以防止光合细菌在冷冻干燥和储藏时候菌体活性的损伤。基础保护剂是满足冷冻干燥时菌体细胞、蛋白质不受外界因素损害的基本成分。增效保护剂是配合基础保护剂共同使用，具有协同作用，增强冻干保护效果。
典型地，本发明中，基础保护剂包括：蔗糖、奶粉(例如脱脂奶粉)、甘露糖、海藻糖。
典型地，本发明中，增效保护剂包括：麦芽糊精、抗坏血酸、谷氨酸钠。
光合细菌培养菌剂
本发明“光合细菌培养菌剂”为生产光合细菌的培养菌剂，具体包括光合细菌冻干粉菌剂和光合细菌培养基；通过将优化后的光合细菌培养基和冻干粉菌剂按照一定的比例混合，制成光合细菌培养菌剂。大量生产光合细菌菌液的过程中，在培养时无需再加入种子菌液，可直接加入水进行培养获得需要体积的光合细菌菌液，简化了培养步骤，缩短了培养周期。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明制备的培养菌剂为粉末状，保存周期长；
(2)本发明制备的培养菌剂便于包装、运输；
(3)本发明生产光合细菌操作方法简单、快速，可一次性制备成需要的体积，解决了现有光合细菌生产，需要先逐级大量制备种子液菌种的繁琐步骤。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(sambrook和russell等人，分子克隆：实验室手册(molecularcloning-alaboratorymanual)(第三版)(2001)cshl出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
应理解，本发明实施方案不局限于以下所列举实施方案，还包括各具体实施方式间的任意组合。
材料和通用方法
实施方案中所述光合细菌为沼泽红假单胞菌。
本发明采用混合后的培养基原料和制备的光合细菌冻干粉菌剂混合后作为生产光合细菌的培养菌剂。
光合细菌培养基原料配比为：磷酸二氢钾：10～50份，磷酸氢二钾：5份，乙酸钠：150～450份，氯化钠：150份，氯化钙：10份，氯化镁：5份，酵母浸粉：50份，蛋白胨：20份，氯化铵：60～280份；硫酸亚铁：1份，硫酸锰1份；配好的光合细菌培养基原料用量为500～1000份。
光合细菌冻干粉菌剂的制备方法为：将培养好的光合细菌菌液加入絮凝剂沉淀半小时，收集菌泥，加入8％蔗糖，6％奶粉，1％麦芽糊精，0.05％抗坏血酸，计算总重量后，再按照1:0.5的比例加入纯水，搅拌均匀，-65度预冻10小时，再放入冻干机中，设置真空度0.02mba，冷冻干燥30小时，得到光合细菌冻干粉菌剂；光合细菌冻干粉菌剂用量20～100份。
本发明生产光合细菌的培养菌剂及其制备方法，具体方案如下：将配比好的光合细菌培养基原料与制备的光合细菌冻干粉菌剂按照一定的比例进行混合，作为生产光合细菌的培养菌剂。然后将培养菌剂按照一定的比例加入自来水溶解在透明密闭容器或者pe塑料袋中，25～40度，2000-4000勒克斯光照强度下培养生产光合细菌。
本发明生产光合细菌的培养菌剂及其制备方法，是将配比好的光合细菌培养基原料和制备的冻干粉菌剂按照一定的比例混合在一起做成固体粉状培养菌剂，然后按照一定的比例加入到水中，按照光合细菌常规的培养方法即可进行，操作较为简单，使用方便，培养周期短，而且便于包装和运输。
实施例1光合细菌冻干粉菌剂的制备方法
固体培养基组成(g/l)：
磷酸氢二钾0.8乙酸钠1.0硫酸镁0.2酵母浸膏8.0琼脂20.0
液体培养基组成(g/l)：
氯化铵2.0磷酸二氢钾0.9乙酸钠4.5磷酸氢二钾0.2酵母膏0.8氯化镁0.3氯化钙0.1硫酸锰0.002硫酸亚铁0.002碳酸氢钠1.0氯化钠0.5蛋白胨0.5na2edta0.02
菌体的收集
在固体培养基上分离得到纯种的沼泽红假单胞菌，固体平板培养在有40w白炽灯光照的厌氧培养箱中进行，30度恒温培养3-5天，见附图1为纯种沼泽红假单胞菌。将纯种的沼泽红假单胞菌菌体刮下来，分别接种在6瓶2.5l的已经灭菌的液体培养基中，在30度恒温培养箱中，40w白炽灯光照下培养3-5天，得到15l纯种的沼泽红假单胞菌。
然后将上述15l纯种的沼泽红假单胞菌接种至装有85l液体培养基的较大透明pe塑料袋，扎紧袋口，塑料袋放置在120l左右的方形塑料大桶里。配液体培养基所用的水为超滤水，已减少杂菌的污染。25-30度，2000-4000勒克斯的光照强度培养5天左右即可成熟。从培养好的菌液收集菌体可以采用离心，板框过滤，絮凝等方式。将上述120l菌液采用高速管式离心机固液分离，可以实现很好的分离效果。高分子的聚合多糖类物质具有一定的絮凝作用，且来源为天然提取，无化工成分。将培养好的菌液转移至大桶中，加入絮凝剂搅拌，静置半小时，菌体全部沉淀在底部，将上清液倒掉，收集菌泥，基本上可以实现菌泥的全部回收。
冻干工艺的优化
微生物的低温真空冷冻干燥，是在收集的菌泥中加入一定的保护剂，先在-70度预冻加有保护剂的菌泥，然后利用低温真空冻干机，直接将已冻结的水分从冰晶状态升华为气态，实现干燥的过程。在冻干的过程中，不同的微生物所用的保护剂的成分也有所差别，因此，需要通过实验确定最佳的保护剂配方以便提高冻干粉的存活率。
发明人将蔗糖与脱脂奶粉作为基础保护剂进行复配，在此基础上添加增效保护剂麦芽糊精与抗坏血酸，混合均匀之后，再按照1:0.5的比例加入纯水，搅拌均匀，-65度预冻10小时，再放入冻干机中，设置真空度0.02mba，冷冻干燥30小时左右，得到光合细菌冻干粉菌剂，见附图2为光合细菌冻干粉菌剂。通过实验确定保护剂的加入比例，结果如下表1所示：
表1
最终得出冻干保护剂的优化配方，8％蔗糖，6％奶粉，1％麦芽糊精，0.05％抗坏血酸，光合细菌冻干粉的存活率可达到72.8％。冻干得到的菌剂需要放置在4度冷藏保存，可存放时间一年之久。
实施例2光合细菌培养菌剂的制备方法
光合细菌培养基原料的组成不同，会影响最终光合细菌培养液的菌体浓度。同时冻干粉菌剂在原料中的用量也影响着最终的菌体浓度。
称取培养基原料，磷酸二氢钾：10g，磷酸氢二钾：5g，乙酸钠：450g，氯化钠：150g，氯化钙：10g，氯化镁：5g，酵母浸粉：50g，蛋白胨：20g，氯化铵：60g；硫酸亚铁：1g；硫酸锰1g；
培养基原料用量的总重量为762g，称取光合细菌冻干粉菌剂20g，将以上物料混合均匀，总重量782g的培养菌剂即配制完成。培养菌剂全部为固体粉状成分，便于包装、运输。782g的培养菌剂一共可以生产100l的液体光合细菌。
具体实施培养10l光合细菌菌液
取上述培养菌剂78.2g，加入10l自来水溶解后成淡红色液体，分装至4个2.5l透明塑料瓶中，放置在恒温培养箱中，设置温度30度，培养箱内放置一个40w白炽灯来提供光源，培养5天之后，菌液颜色即可变成深红色，经分光光度计od600测量后可以达到1.6，ph为8.9，活菌数约为35亿/ml，可以满足应用的需求。那么，在这个培养周期内，活菌数是否还有提升的空间，对此，通过增加冻干粉菌剂的用量，相当于提高菌种初始接种量，同时对培养基原料中盐离子的含量进一步优化，以缩短培养周期，提高活菌含量。
实施例3光合细菌培养菌剂的制备方法
调整光合细菌培养基原料中的相关成分含量，使得整个原料总重量为967g，调整后原料组成如下：
称取培养基原料，磷酸二氢钾：50g，磷酸氢二钾：5g，乙酸钠：450g，氯化钠：150g，氯化钙：10g，氯化镁：5g，酵母浸粉：30g，蛋白胨：15g，氯化铵：250g；硫酸亚铁：1g；硫酸锰1g；
光合细菌冻干粉菌剂的用量增加到100g，将以上物料混合均匀，总重量1067g的培养菌剂即配制完成。一共可以生产100l的液体光合细菌。
具体实施培养10l光合细菌菌液
取上述培养菌剂106.7g，加入10l自来水溶解后成红色液体，分装至4个2.5l透明塑料瓶中，放置在恒温培养箱中，设置温度25度，培养箱内放置一个40w白炽灯来提供光源，培养4天之后，从瓶子外观看，菌液颜色为深红色，瓶中含有非常明显的红色菌体成分，ph为9.1，经分光光度计od600测量后可以达到1.9，活菌数约为91亿/ml。优化了培养基原料用量与冻干粉菌剂用量之后，培养时间可缩短一天，同时菌体含量得到大幅提升，完全可以满足应用需求。
实施例4利用培养菌剂大量生产光合细菌菌液
在光合细菌的实际生产中，要想获得大批量的菌液，首先需要制备一定量的种子菌液。例如，初始只有4l的种子菌液，需要生产500l光合细菌菌液，按照20％的接种量计算，首先需要提供100l的种子液，而这100l种子液的获得又需要20l的种子菌液，同样20l的菌液也需要4l的初始菌液，由此可以看出，生产500l的光合细菌菌液，需要做三级的培养才能够获得，按照一个周期4天计算，总共需要12天。而通过本发明改进后的培养菌剂可在4天时间，一次性即可生产500l的光合细菌菌液。
具体实施培养500l光合细菌菌液
准备2个300l透明塑料桶，每个桶里称取2667.5g培养菌剂，加入250l自来水溶解为红色的液体，在液体表面覆盖一层塑料袋膜，以提供培养的厌氧环境，采用水族加热器设置温度30度加热，同时采用白炽灯提供3000勒克斯左右的光源照射。经过4天左右的培养，2个塑料桶菌液均已变成深红色浓稠菌液，分光光度计od600检测1.85左右，ph为9.2，活菌数约80亿/ml。
实施例5光合细菌培养菌剂常温下保存
将光合细菌培养菌剂装在铝箔袋中封口，置于阴凉、干燥、室温下存放。分别对3个月，6个月，12个月保存时间的样品进行培养，检验菌剂是否依然能够培养出光合细菌菌液。经过培养，3个月和6个月的样品都在第4天左右就转变成深红色，菌液浓度高，od600可以达到1.8左右，活菌数约70亿/ml，满足应用需求。12个月的样品经过培养，需要5天左右变成深红色，od600达到1.7左右，活菌数约60亿/ml，也可以满足应用需求。
由此可见，保存时间半年内的样品基本上对生产培养没有影响，保存1年的样品进行生产光合细菌的时候，培养成熟周期会多2天左右，也不会太影响使用效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。