本发明涉及调节精子运动能力及辅助生殖的化合物及其用途。
背景技术：
：近年来，随着工业化不断发展，环境污染、生活方式改变及精神心理压力过大等因素导致不孕不育发病率逐年上升，在育龄夫妇中不孕不育比例高达15％～20％。其中50％是因为男方因素所致。根据who规定，育龄夫妇有一年以上规律的性生活，并且未采取任何避孕措施，主要因为男方原因造成女方无法自然受孕称为男性不育症。而男性不育的一个重要原因是少弱精子症，这其中少弱精子症约占男性不育因素的3/4。目前，世界卫生组织颁布的最新《人类精液实验室检验手册》(第五版)中规定，前向运动精子率小于32％诊断为弱精子症。弱精子症不是一种独立的疾病，而是由多种疾病或因素造成的。西药针对病因的治疗，以及各种激素的应用，临床疗效还不够理想。而基因治疗目前也正处于研究阶段，并未在临床上推广应用。随着医学的发展，辅助生殖技术art(体外受精ivf、单精子胞内注射技术icsi)作为一种新的治疗方法，有效地提高了少弱精子症患者的受孕率，但并未从根本上改善患者的精子质量。中医依靠其整体观及辨证体系，因证因病因人施治，治疗少弱精子症有一定的优势，且疗效显著，但对遗传因素导致的严重少弱精子症效果并不理想。在体内受精时，具有良好运动能力的精子能迅速游至输卵管，与卵子结合受精；在体外受精时，运动能力良好的精子能够穿透卵子的卵丘和透明带顺利进入卵质中完成受精。由此看来，精子的运动能力对于受孕起着至关重要的作用，维持和提高精子的活力，对于提高辅助生殖的成功率也有着重要的作用。因此，发现一种能够提高精子运动能力的药物就显得尤为重要。目前借助实验室手段可以在体外提高精子功能，通常是在精液中添加一些有利于延缓精子衰老和提高精子活力的成分，来改善精子的运动能力、延长体外存活时间，从而达到提高受精率的目的。能够提高精子活力并进一步提高其受精能力的物质种类很多。这些外源性物质主要有咖啡因、氨基多糖类物质、己酮可可碱、生殖激素、血小板活化因子、维生素和其他一些物质等。不同物质的应用效果差异较大。在人工授精技术的应用上，通过添加这些物质，来改善人工授精效果的应用也较少。主要原因在于大多数研究者认为，人工授精技术已经非常成熟，因此对人工授精技术缺乏进一步的研究；另一方面，通过添加一些物质会使人工授精技术的成本增加。所以，寻找高效低成本物质具有重要意义。提高精子活力、存活时间、促进其获能及增强其对卵母细胞的穿透能力是非常复杂的生物学过程，与许多激素、细胞因子有关。不但要研究精子运动及存活能力维持的分子机制，同时更应该系统地研究添加物质后对精子受精能力和受精效果的影响，以及对人工授精技术应用效益的影响；如果条件允许，应该进一步研究在精液中添加这些物质对早期胚胎发育、胚胎附植等后续繁殖过程的影响，甚至是否会造成后代遗传结构、生存能力的改变，为这些添加物安全、高效的使用奠定基础。尽管辅助生殖技术能从一定程度上解决了精子受精和不育的问题，但辅助生殖技术art的价格高昂。此外，art特别是导致的子代的潜在健康风险仍然值得关注。icsi技术产生的子代患代谢性疾病以及其它缺陷的风险增加。如果能通过治疗或者调控手段改善少弱精子症患者精子质量，进而获得自然条件下的妊娠，具有显著的经济和健康效益。对于其它的哺乳动物，特别是在畜牧方面，牛、猪等动物常采用商品化的冷冻精液人工授精技术来扩大繁殖并且保持良好的性状。通过采用精子功能的调控技术，可以提高牛冷冻精液应用的效果，减少成本。技术实现要素：本发明第一方面提供下式i所示化合物或其药学上可接受的盐在制备促进精子运动能力和/或延长精子运动时间的药物或药盒中的应用，或在制备用于辅助生殖的药物或药盒中的应用：式中，r1和r2与其所连接的n一起形成任选被1或2个c1-c4烷基取代的哌嗪基或吗啡啉基；r3为c3-c8环烷基，或者为-nrarb，其中，ra和rb与其所连接的n一起形成任选被1或2个c1-c4烷基取代的哌啶基、环己亚胺基、吡咯烷基或吗啡啉基；和r4和r5各自独立为h或c1-c4烷基；或者r5与r6一起连接形成c3-c5亚烷基。在某些实施方案中，r1与r2与其所连接的n一起形成无取代的哌嗪基。在某些实施方案中，ra与rb与其所连接的n一起形成无取代的吡咯烷基。在某些实施方案中，r4与r5各自为c1-c4烷基。在某些实施方案中，r1与r2与其所连接的n一起形成无取代的哌嗪基；r3为c3-c8环烷基；和r4与r5各自为c1-c4烷基。在某些实施方案中，所述式i化合物为：本发明还提供一种体外促进精子运动能力和/或延长精子运动时间的方法，所述方法包括使精液与下式i所示的化合物或其药学上可接受的盐接触的步骤：式中，r1和r2与其所连接的n一起形成任选被1或2个c1-c4烷基取代的哌嗪基或吗啡啉基；r3为c3-c8环烷基，或者为-nrarb，其中，ra和rb与其所连接的n一起形成任选被1或2个c1-c4烷基取代的哌啶基、环己亚胺基、吡咯烷基或吗啡啉基；和r4和r5各自独立为h或c1-c4烷基；或者r5与r6一起连接形成c3-c5亚烷基。在某些实施方案中，所述精液来自少弱精症患者。在某些实施方案中，r1与r2与其所连接的n一起形成无取代的哌嗪基。在某些实施方案中，ra与rb与其所连接的n一起形成无取代的吡咯烷基。在某些实施方案中，r4与r5各自为c1-c4烷基。在某些实施方案中，r1与r2与其所连接的n一起形成无取代的哌嗪基；r3为c3-c8环烷基；和r4与r5各自为c1-c4烷基。在某些实施方案中，所述式i化合物为：在某些实施方案中，所述接触包括使式i所示化合物或其药学上可接受的盐以100um以下的浓度与精液接触。附图说明图1：与lee011孵育1h、3h和5h后测得的精子参数，包括精子活力sm％，前向运动pr％，直线速度vsl，平均路径速度vap，精子头侧摆幅度alh，直线性lin，前向性str和鞭打频率bcf。具体实施方式应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。本发明发现，使用本发明所述式i化合物或其药学上可接受的盐能够使精子运动能力显著提高，运动时间显著延长，并对受精及胚胎发育无不利影响。因此，本发明提供本发明所述式i化合物或其药学上可接受的盐在制备促进精子运动能力和/或延长精子运动时间的药物或药盒中的应用，以及在制备用于辅助生殖的药物或药盒中的应用。具体而言，本发明式i化合物具有以下结构：式中，r1和r2与其所连接的n一起形成任选被1或2个c1-c4烷基取代的哌嗪基或吗啡啉基；r3为c3-c8环烷基，或者为-nrarb，其中，ra和rb与其所连接的n一起形成任选被1或2个c1-c4烷基取代的哌啶基、环己亚胺基、吡咯烷基或吗啡啉基；和r4和r5各自独立为h或c1-c4烷基；或者r5与r6一起连接形成c3-c5亚烷基。在某些实施方案中，r1与r2与其所连接的n一起形成无取代的哌嗪基。在某些实施方案中，r3为环丁基、环戊基或环己基，或ra与rb与其所连接的n一起形成无取代的吡咯烷基。在某些实施方案中，r4与r5各自为c1-c4烷基。在某些实施方案中，r1与r2与其所连接的n一起形成无取代的哌嗪基；r3为环丁基、环戊基或环己基；r4与r5各自为c1-c4烷基。在某些实施方案中，所述式i化合物为lee011(7-环戊基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸二甲酰胺)，即：本发明式i化合物可参照化合物lee011的方法制备得到。应理解的是，本文所述的“药学上可接受的盐”包括本领域周知的各种可药用盐。本发明还提供一种体外促进精子运动能力和/或延长精子运动时间的方法，所述方法包括使精液与本文所述的式i化合物或其药学上可接受的盐接触的步骤。本发明中，精子运动能力包括但不限于精子活力、前向运动、直线速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度、直线性、前向性和鞭打频率中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明尤其涉及精子活力、前向运动、平均路径速度和鞭打频率中的一种或多种的改善或提高。通常，获取精液后，将精液与常规的精子细胞培养液如bww培养基混合，离心后重悬，然后加入本文所述的式i化合物或其药学上可接受的盐培养合适的时间。通常，式i化合物或其药学上可接受的盐的加入浓度在100um以内，例如1～100um。培养可在常规的培养条件下进行，例如在37℃、5％co2的培养箱中进行。精液可来自任何有需要的个体，尤其是来自少弱精症患者。或者，在某些实施方案中，使用本文所述的含有本文所述式i化合物或药学上可接受的盐的培养基重悬上述离心后获得的精子细胞。本发明还提供用于促进精子运动能力和/或延长精子运动时间或用于辅助生殖的式i化合物或其药学上可接受的盐。在某些方面，本发明还提供一种培养基，其含有用于精子培养的基础培养基，并添加有式i化合物或其药学上可接受的盐。用于精子培养的基础培养基可以是本领域周知的各种适用于精子培养的培养基，如bww。式i化合物或其药学上可接受的盐在该基础培养基中的浓度可以在1～100um的范围内，例如，式i化合物或其药学上可接受的盐可在1-50um、1-20um或5-15um的范围内。在某些方面，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有式i化合物或其药学上可接受的盐。该试剂盒可用于促进精子运动能力和/或延长精子运动时间，或用于辅助生殖。试剂盒中还可含有其它合适的试剂，例如用于精子培养的培养基。式i化合物或其药学上可接受的盐和培养基可独立包装或以混合物的形式提供。因此，在某些实施方案中，所述试剂盒含有本文所述的培养基。下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明。除非另有说明，实施例中所用到的方法和试剂均为本领域常规的方法和试剂。实施例1：lee011体外促进弱精子症精子运动的效果获取来源于医院门诊就诊的禁欲48h-7d的30例少弱精症患者的精子样本于干燥无菌的取精杯内，37℃、60min内完全液化。每份精液按照精液：培养基(bww，上海通善生物科技有限公司)＝1:1的比例置于离心管中，300g、15min离心后重悬(终浓度为5*10^6个/ml)，重悬液等分为药物组及对照组，药物组加入终浓度为10um的lee011，对照组加入等体积灭菌水。在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1h、3h、5h后用全自动精子质量分析仪casa(nos，hamilton-thornresearch,inc.，beverly，ma，usa)对精子参数(精子活力sm％，前向运动pr％，直线速度vsl，平均路径速度vap，精子头侧摆幅度alh，直线性lin，前向性str，鞭打频率bcf)进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的精子数不少于800个。结果如图1所示。结果表明，以上各项指标加药组比对照组的值均有增加，其中sm，spm，vap，bcf具有统计学差异。实施例2：lee011提升精子在培养液中的存活时间(至丧失活动性的时间)同实施例1采集精子样本及分组，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育，每5小时，采用全自动精子质量分析仪测定培养物中的游动精子百分数。当前向运动的精子少于5％时，样本被视为不再有活力。详细结果见表1。结果表明，药物组的精子存活时间显著高于正常组。表1实施例3：lee011提高弱精子症的精卵结合和受精能力未性成熟雌性仓鼠腹腔注射血促性素pmsg(60iu/只)，48h后注射绒促性素hcg(100iu/只)，12-15小时后处死促排卵雌鼠，打开腹腔取出输卵管，置于平衡后的bww中，将输卵管壶腹部撕开使卵丘-卵母细胞复合物流出，去除输卵管和组织碎片，按10％的比例加入透明质酸酶(hy)，待卵丘细胞脱落后，在bww中洗3次，移入台式液中去透明带，再在bww中洗3次，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中备用。雄鼠处死后取其附睾上体尾部，用眼科镊挤压附睾尾，让精液流出，用精子分析仪进行检测，前向运动小于50％为弱精子，大于50％的为正常精子。在弱精子中加入lee011，使其终浓度为10μm，将正常精子组、弱精子组合弱精子+lee011组放入平衡的htf管，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1h使其获能，将获能的精子与去透明带的仓鼠卵母细胞再在37℃、5％二氧化碳培养箱孵育3小时。用醋酸-地衣红染色剂进行染色，并用显微镜计数穿透每一卵母细胞的精子数目及被穿透的卵母细胞数目，详细结果见表2。结果表明，lee011作用于弱精子后穿透卵细胞的穿透率、受精指数与弱精子组相比显著提高，接近正常精子组的水平。表2分组正常精子弱精子弱精子+lee011总卵子数424044穿透卵子数22321膨大头数17517穿透率(％)52.47.547.7受精指数0.40.130.39实施例4：提高体外受精率及桑椹胚、囊胚生成率未性成熟雌性小鼠腹腔注射血促性素pmsg(10iu/只)，48h后注射绒促性素hcg(10iu/只)，12-15小时后处死促排卵雌鼠，打开腹腔取出输卵管置于h-czb液滴内，将输卵管壶腹部撕开，使卵丘-卵母细胞复合物流出。去除输卵管和组织碎片，将团状复合物转移至预先平衡好的milliporeksom(mr-020p-d)中，每滴1-2团复合物。置于37℃，5％二氧化碳培养箱中备用。雄鼠处死后取其附睾上体尾部，用眼科镊挤压附睾尾，让精液流出，用精子分析仪进行检测，前向运动小于50％为弱精子，大于50％的为正常精子。在弱精子中加入lee011，使其终浓度为10μm，将正常精子组、弱精子组合弱精子+lee011组放入平衡的htf管中使其获能1h。受精时用移液枪吸取适量精子到含有卵丘-卵母细胞复合物的ksom受精滴中，精子终浓度控制在1-2*10^6个/ml。培养8-10h，再将卵子转移至含有透明质酸酶(hy)的h-czb小滴中放置约5min并轻轻吹打使卵丘细胞与卵母细胞分离后继续在37℃，5％二氧化碳中培养。此过程中计算受精率(受精卵子数/总卵子数)，24小时后观察2-cell率(2-cell/受精卵数)，48小时候观察4-cell率(4-cell/受精卵数)，72小时观察桑椹胚率(桑椹胚数/受精卵数)，96小时观察囊胚率(囊胚数/受精卵数)，详细结果见表3。结果表明，lee011可以提高ivf的受精率以及桑椹胚、囊胚生成率。表3实施例5：毒性实验同实施例1中样本采集，按照精液：培养基(bww)＝1:1的比例置于离心管中，300g、15min离心后重悬，重悬液设置lee011浓度梯度100um，50um，25um，12.5um，6.25um及对照组，将各组样本在25摄氏度下放置24h后，用全自动精子质量分析仪测定培养物中的游动精子百分数。结果如下表4所示。结果表明，lee011在100um以下浓度对于精子均无毒性作用。表4样本1样本2样本3100um46％50％55％50um40％46％53％25um42％47％49％12.5um39％47％49％6.25um36％43％47％0um35％39％43％当前第1页12