本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测brafv600e基因突变的方法。
背景技术：
braf基因(v-raf鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体b1)定位在7号染色体上，编码braf激酶，在多种恶性肿瘤中均发现有突变，其中brafv600e位点的单基因突变常发生在甲状腺乳头状癌中。它与肿瘤的中央区淋巴结转移和侵袭性密切相关，对于brafv600e进行基因检测有助于临床医生判断术中是否需要预防性清扫颈部淋巴结。现常用的brafv600e的方法包括sanger测序法、荧光定量-聚合酶链式反应(rt-pcr)、免疫组化技术(ihc)等。sanger测序法的优点是准确性较高可检测已知和未知突变，但是灵敏度较低(只有在突变率达到50％以上是才可检测到)成本较高，耗时长。rt-pcr检测较为精准，当前使用较多，但其成本高、空间及人员要求高且只能检测已知突变。免疫组化法用特异性抗体ve1识别v600e突变蛋白，在蛋白水平上推测brafv600e基因突变，具有较好的灵敏度和特异度，但无法精确检测突变碱基并且只能检测已知突变。近年来，核酸探针作为基因探针的一种，具有很强的亲和力和选择性，被广泛应用于生化分析中。
生物芯片是目前基因组学，蛋白质组学研究的重要工具，具有高通量，并对检测样品消耗量少等优点(基因生物学，genomebiol.2001，2，research0004.1～0004.13)，由于基因探针分子与靶分子的结合具有高灵敏度、高特异性的特点，因此将核酸探针、brafv600e突变基因的特异性识别与生物芯片结合在一起的技术还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有检测brafv600e基因突变的方法操作繁杂，样品消耗量大，难于微型化及低通量的问题，而提供一种检测brafv600e基因突变的方法。
本发明提供一种检测brafv600e基因突变的方法，包括以下步骤：
步骤一：将两种brafv600e基因探针与点样液混合得到两种brafv600e基因探针点样溶液，然后在基片上进行点样，得到brafv600e捕获基因芯片；
步骤二：将细胞或组织中提取的dna进行两步不对称pcr反应，得到单链待检测目的基因；
步骤三：将步骤一得到的brafv600e捕获基因芯片上的基因探针与步骤二得到的待检测基因的目的基因片段或纯突变型待检测目的基因片段进行杂交反应，得到基因探针-目的基因二聚体生物芯片；
步骤四：将步骤三得到的基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链杂交溶液进行杂交反应，得到荧光标记的brafv600e生物芯片；
步骤五：将步骤四得到的荧光标记的brafv600e生物芯片放入微阵列扫描仪中进行检测，得到brafv600e生物芯片的荧光检测信号，实现对brafv600e基因突变的检测。
优选的是，所述的两种brafv600e基因探针为突变型和野生型。
优选的是，所述的步骤一中的brafv600e基因探针的浓度为10～50μm。
优选的是，所述的步骤一中的基因探针为3’-nh2修饰的dna探针。
优选的是，所述步骤二中的不对称pcr两步的条件均为：先在94℃下反应3分钟；然后依次在94℃下反应30秒，47℃下反应20秒，68℃下反应20秒，30个循环；最后在68℃下反应5分钟；4℃保存。
优选的是，所述的步骤三具体为：
将待检测基因的目的基因片段或纯突变型待检测目的基因片段放入杂交溶液中，得到待检测基因的目的基因片段的杂交溶液或或纯突变型待检测目的基因片段杂交溶液，然后浸入沸水中加热2min～3min，迅速加样到brafv600e捕获基因芯片上后放在40～47℃，25％～45％相对湿度的恒温恒湿箱中，使brafv600e捕获基因芯片上的brafv600e基因探针与待检测基因的dna互补链进行杂交反应，反应2小时，完毕后经过洗涤，得到基因探针-目的基因二聚体生物芯片。
优选的是，所述的杂交溶液包括：质量分数0.1％～0.2％的十二烷基硫酸钠，ph＝7.0的含有0.4mol/l～0.5mol/l氯化钠和40mmol/l～50mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液。
优选的是，所述的待检测基因的目的基因片段的杂交溶液中待检测基因的目的基因片段的浓度为0.01nm～100nm。
优选的是，所述的步骤四的杂交反应是在温度为30℃，相对湿度为25％～45％的恒温恒湿箱中进行。
优选的是，所述的步骤四中cy5标记的dna互补链杂交溶液是将cy5标记的dna互补链放入杂交溶液中得到的，所述的cy5标记的dna互补链的浓度为0.1μm～0.2μm。
发明原理
本发明一种检测brafv600e基因突变的方法，该方法采用dna微阵列技术，固定基因探针，与突变基因片段杂交后形成二聚体，再以带有荧光染料cy5的dna互补链为标记物，通过杂交反应标记生物芯片，结合微阵列荧光扫描仪，获得生物芯片上荧光染料的荧光信号，可实现对brafv600e基因突变的定向检测。
本发明的有益效果
本发明提供的一种检测brafv600e基因突变的方法，该检测方法简便、样品消耗少，时间消耗短，具有通用性，灵敏度可达到0.1nm，检测范围宽，实验结果表明：利用本方法所获得的brafv600e基因突变的检测范围为：0μm～100μm，当其浓度为100μm时，荧光信号趋于饱和；brafv600e基因突变检测限为：0.1nm，等位基因频率低至0.1％，检测范围为：3个数量级。
附图说明
图1是本发明所述的检测brafv600e基因突变的方法过程示意图；
图2是用本发明的方法所获得的合成突变型dna序列经两步杂交反应后的点阵光学图片；
图3是用本发明的方法所获得的brafv600e突变基因不同浓度的点阵光学图片；
图4是用本发明的方法所获得的brafv600e突变基因检测的标准点图；
图5是用本发明的方法所获得的brafv600e突变基因检测的等位基因频率点阵光学图片和标准点图；
图6是用本发明方法对实际临床样本进行检测所得到的点阵光学图片。
具体实施方式
本发明提供一种检测brafv600e基因突变的方法，包括以下步骤：
步骤一：将两种brafv600e基因探针与点样液混合得到两种brafv600e基因探针点样溶液，然后在基片上进行点样，得到brafv600e捕获基因芯片；
步骤二：将细胞或组织中提取的dna进行两步不对称pcr反应，得到单链待检测目的基因；
步骤三：将步骤一得到的brafv600e捕获基因芯片上的基因探针与步骤二得到的待检测基因的目的基因片段或纯突变型待检测目的基因片段进行杂交反应，得到基因探针-目的基因二聚体生物芯片；
步骤四：将步骤三得到的基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链杂交溶液进行杂交反应，得到荧光标记的brafv600e生物芯片；
步骤五：将步骤四得到的荧光标记的brafv600e生物芯片放入微阵列扫描仪中进行检测，得到brafv600e生物芯片的荧光检测信号，实现对brafv600e基因突变的检测。
按照本发明，将两种(即突变型和野生型，所述的突变性brafv600e基因探针具有seqno.1序列，野生性brafv600e基因探针具有seqno.2序列)brafv600e基因探针和点样液混合得到brafv600e基因探针点样溶液，所述的brafv600e基因探针点样溶液中brafv600e基因探针的浓度优选为10～50μm，更优选为30μm，所述的brafv600e基因探针优选为3’-nh2修饰的dna探针(3’-nh2修饰的dna探针选自上海生工生物工程技术服务有限公司)，取10μl～20μl所述样品溶液于样品板中，在smartarrayer48生物芯片点样系统上进行点样(生物芯片选用北京博奥生物技术有限公司生产的
按照本发明，所述的步骤二中将细胞或组织中提取的dna作为模板，取1μl模板，加入1μl正向引物f1(所述的正向引物f1具有seqno.3序列)，1μl反向引物r1(所述的反向引物r1具有seqno.4序列)，10μl的onetaqdna聚合酶(选用newenglandbiolabs生产的onetaqdna聚合酶)，7μl灭菌水，组成20μlpcr体系，进行第一步pcr反应。所述pcr反应条件优选为：先在94℃下反应3分钟；然后依次在94℃下反应30秒，47℃下反应20秒，68℃下反应20秒，30个循环；最后在68℃下反应5分钟；4℃保存。将第一步pcr产物作为第二步pcr的模板，取2.5μl模板加入2.5μl正向引物f1，25μl的onetaqdna聚合酶，20μl灭菌水，组成50μlpcr体系，进行第二步pcr反应。所述的第二步pcr反应的条件优选为：先在94℃下反应3分钟；然后依次在94℃下反应30秒，47℃下反应20秒，68℃下反应20秒，30个循环；最后在68℃下反应5分钟；4℃保存。所得的产物直接用于步骤三中的杂交反应。
按照本发明，将0.01nm～100nm待检测基因的目的基因片段或0.01nm～100nm纯突变型待检测目的基因片段(dna合成选自上海生工生物工程技术服务有限公司，纯突变型待检测目的基因片段具有seqno.6序列)放入25μl～30μl杂交溶液中，得到待检测基因的目的基因片段的杂交溶液或者纯突变型待检测目的基因片段的杂交溶液，然后浸入沸水中加热2min～3min，迅速加样到brafv600e捕获基因芯片上后放在40～47℃，25％～45％相对湿度的恒温恒湿箱中，使brafv600e捕获基因芯片上的brafv600e基因探针与待检测基因的dna互补链进行杂交反应，反应2小时，完毕后依次用洗液1冲洗10～20秒，并在37℃条件下洗涤3次，每次3min～4min；再用洗液2在室温下洗涤3次，每次4min～5min；最后用4℃milli-q超纯水洗涤3次，每次2min～3min，离心干燥1min～2min，得到基因探针-目的基因二聚体生物芯片。所述的杂交溶液优选为：质量分数0.1％～0.2％的十二烷基硫酸钠，ph＝7.0的含有0.4mol/l～0.5mol/l氯化钠和40mmol/l～50mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液。所述的洗液1优选为：含有0.01％～0.02％的十二烷基硫酸钠，0.6mol/l～0.8mol/l氯化钠60mmol/l～70mmol/l，柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液(ph＝7.0)；洗液2优选为：含有0.01％～0.02％的十二烷基硫酸钠，0.15mol/l～0.16mol/l氯化钠15mmol/l～17mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液(ph＝7.0)。
按照本发明，所述的步骤四中将基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链(cy5标记的dna互补链具有seqno.5序列)杂交溶液进行杂交反应，25μl～30μl含有200nm的cy5标记的dna互补链的杂交溶液在温度为30℃，相对湿度为25％～45％条件下，反应1小时，完毕后先用洗液1冲洗10～20秒，并在室温下洗涤3次，每次3min～4min；再用milli-q超纯水洗涤3次，每次2min～3min，离心干燥1min～2min，得到荧光标记的brafv600e生物芯片。所述的cy5标记的dna互补链的杂交溶液优选为：质量分数0.1％～0.2％的十二烷基硫酸钠，ph＝7.0的含有0.1mol/l～0.2mol/l氯化钠和10mmol/l～20mmol/l柠檬酸三钠(二水)的缓冲溶液。所述的洗液1优选为：含有0.01％～0.02％的十二烷基硫酸钠，0.15mol/l～0.16mol/l氯化钠15mmol/l～17mmol/l柠檬酸三钠(二水)的缓冲溶液(ph＝7.0)。
按照本发明，所述的步骤五中将基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链进行杂交作用后的生物芯片放入北京博奥生物技术有限公司生产的luxscan-10k/a型微阵列扫描仪中进行检测，得到brafv600e生物芯片的荧光检测信号，可实现对brafv600e基因突变的检测。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
1、将两种brafv600e基因探针(即突变型和野生型，所述的突变性brafv600e基因探针具有seqno.1序列(5’-gatttctctgtagct-t10-nh2-3’)，野生性brafv600e基因探针具有seqno.2序列(5’-gatttcactgtagct-t10-nh2-3’))与点样液混合得到brafv600e基因探针溶液(dna合成选自上海生工生物工程技术服务有限公司)，brafv600e基因探针的浓度为30μmol/l，取15μl所述样品溶液于样品板中，在smartarrayer48生物芯片点样系统上进行点样(生物芯片应用标准的制作方法，选用北京博奥生物技术有限公司生产的
2、将步骤1得到的浓度为30μmbrafv600e捕获基因芯片与浸入沸水中加热3min后的纯突变型待检测目的基因片段(dna合成选自上海生工生物工程技术服务有限公司，纯突变型待检测目的基因片段具有seqno.6序列(5’-gattttggtctagctacagagaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatcc-3’))的杂交溶液，迅速加样后放在44℃，40％相对湿度的恒温恒湿箱中，反应2小时，完毕后依次用洗液1冲洗20秒，并在37℃条件下洗涤3次，每次4min；再用洗液2在室温下洗涤3次，每次5min；最后用4℃的milli-q超纯水洗涤3次，每次3min，离心干燥1min，得到基因探针-目的基因二聚体生物芯片；所述的杂交溶液为：质量分数0.15％的十二烷基硫酸钠，ph＝7.0的含有0.45mol/l氯化钠和45mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液。所述的洗液1为：含有0.01％的十二烷基硫酸钠，0.6mol/l氯化钠，60mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液(ph＝7.0)；洗液2为含有0.01％的十二烷基硫酸钠，0.15mol/l氯化钠，15mmol/l柠檬酸三钠(二水)的缓冲溶液(ph＝7.0)；
3、将步骤2得到的基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链(cy5标记的dna互补链具有seqno.5序列(5’-cy5-t10-ggatccagacaactg-3’))进行杂交反应，在芯片上加入25μl含有200nm的cy5标记的dna互补链的杂交溶液，在温度为30℃，相对湿度为40％条件下，反应1小时，完毕后先用洗液1冲洗10～20秒，并在室温下洗涤3次，每次4min；再用4℃的milli-q超纯水洗涤3次，每次3min，离心干燥1min，得到荧光标记的brafv600e生物芯片。所述的cy5标记的dna互补链的杂交溶液为：质量分数0.15％的十二烷基硫酸钠，ph＝7.0的含有0.15mol/l氯化钠和15mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液。所述的洗液1为：含有0.015％的十二烷基硫酸钠，0.15mol/l氯化钠16mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液(ph＝7.0)。
4、所述的步骤3中将基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链进行杂交作用后的生物芯片放入北京博奥生物技术有限公司生产的luxscan-10k/a型微阵列扫描仪中进行检测，得到brafv600e生物芯片的荧光检测信号。
按照以上实验步骤，得到的结果如图2、图3、图4和图5所示。
图2是用本发明实施例1的方法所获得的突变型合成目的基因片段浓度为10nm时的荧光信号的点阵光学图片；其中，待测目的基因的浓度为10nm，cy5标记的dna互补链的浓度为200nm。图中第一列点阵检测突变型brafv600e基因，第二列检测野生型brafv600e基因；
图3是用本发明实施例1的方法所获得的brafv600e突变基因不同浓度的点阵光学图片，其中，探针brafv600e基因探针的浓度为30μm，待测目的基因片段的浓度为0.01nmol/l，0.025nmol/l，0.05nmol/l，0.1nmol/l，0.25nmol/l，0.5nmol/l，1nmol/l，2.5nmol/l，5nmol/l，10nmol/l，50nmol/l，100nmol/l，cy5标记的dna互补链的浓度为200nm；
图4是用本发明实施例1的方法所获得的brafv600e突变基因检测的标准点图，它们分别表示在brafv600e捕获基因芯片上，荧光信号随着待测目的基因片段浓度的变化而变化的图像以及相应的数据提取图，其中横坐标为待测目的基因片段的浓度，纵坐标为荧光信号强度比，探针brafv600e的浓度为30μm，待测目的基因的浓度为0.1～100nm，cy5标记的dna互补链的浓度为200nm，利用这一方法所获得的brafv600e突变基因的检测限为：0.1nmol/l，其中，荧光信号随着brafv600e突变基因浓度的增加而增加，当其浓度为100μm时，荧光信号趋于饱和。
图5是用本发明实施例1的方法所获得的不同等位基因频率的条件下，突变型纯目的基因在不同等位基因频率的情况下的荧光信号的点阵光学图片(图a)和标准点图(图b)。其中，探针brafv600e的浓度为30μm，等位基因频率从0.01％到45％，合成目的基因片段总等位基因浓度为20nm时，cy5标记的dna互补链的浓度为200nm。
实施例2
1、将两种brafv600e基因探针(即突变型和野生型，所述的突变性brafv600e基因探针具有seqno.1序列，野生性brafv600e基因探针具有seqno.2序列)与点样液混合得到brafv600e基因探针溶液(dna合成选自上海生工生物工程技术服务有限公司)，brafv600e基因探针的浓度为30μmol/l，取15μl所述样品溶液于样品板中，在smartarrayer48生物芯片点样系统上进行点样(生物芯片应用标准的制作方法，选用北京博奥生物技术有限公司生产的
2、将步骤1得到的浓度为30μmbrafv600e捕获基因芯片与浸入沸水中加热3min后的人组织提取dna进行不对称pcr后产物的杂交溶液，迅速加样后放在44℃，40％相对湿度的恒温恒湿箱中，反应2小时，完毕后依次用洗液1冲洗20秒，并在37℃条件下洗涤3次，每次4min；再用洗液2在室温下洗涤3次，每次5min；最后用4℃的milli-q超纯水洗涤3次，每次3min，离心干燥1min，得到基因探针-目的基因二聚体生物芯片；所述的组织提取dna进行不对称pcr的过程为：取1μl组织提取dna作为模板，加入1μl正向引物f1，(所述的正向引物f1具有seqno.3序列(5’-aggtgattttggtctagctaca-3’))，1μl反向引物r1(所述的反向引物r1具有seqno.4序列(5’-ggatccagacaactgttcaaac-3’))，10μl的onetaqdna聚合酶(选用newenglandbiolabs生产的onetaqdna聚合酶)，7μl灭菌水，组成20μlpcr体系，进行第一步pcr。条件为：94℃3分钟；94℃30秒，47℃20秒，68℃20秒，30个循环；68℃5分钟；缓慢降温至4℃保存。将第一步pcr产物作为第二步pcr的模板，取2.5μl模板加入2.5μl正向引物f1，25μl的onetaqdna聚合酶，20μl灭菌水，组成50μlpcr体系，在相同条件下进行第二步pcr。所得的产物溶于杂交溶液后用于芯片杂交反应；所述的杂交溶液为：质量分数0.15％的十二烷基硫酸钠，ph＝7.0的含有0.45mol/l氯化钠和45mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液。所述的洗液1为：含有0.01％的十二烷基硫酸钠，0.6mol/l氯化钠，60mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液(ph＝7.0)；洗液2为含有0.01％的十二烷基硫酸钠，0.15mol/l氯化钠，15mmol/l柠檬酸三钠(二水)的缓冲溶液(ph＝7.0)；
3、将步骤2得到的基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链(cy5标记的dna互补链具有seqno.5序列)进行杂交反应，在芯片上加入25μl含有200nm的cy5标记的dna互补链的杂交溶液，在温度为30℃，相对湿度为40％条件下，反应1小时，完毕后先用洗液1冲洗10～20秒，并在室温下洗涤3次，每次4min；再用4℃的milli-q超纯水洗涤3次，每次3min，离心干燥1min，得到荧光标记的brafv600e生物芯片。所述的cy5标记的dna互补链的杂交溶液为：质量分数0.15％的十二烷基硫酸钠，ph＝7.0的含有0.15mol/l氯化钠和15mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液。所述的洗液1为：含有0.015％的十二烷基硫酸钠，0.15mol/l氯化钠16mmol/l柠檬酸三钠(二水)缓冲溶液(ph＝7.0)。
4、所述的步骤3中将基因探针-目的基因二聚体生物芯片与cy5标记的dna互补链进行杂交作用后的生物芯片放入北京博奥生物技术有限公司生产的luxscan-10k/a型微阵列扫描仪中进行检测，得到brafv600e生物芯片的荧光检测信号。
按照以上实验步骤，我们得到的结果如图6所示。
图6是用本发明方法对实际临床样本进行检测所得到的点阵光学图片，其样本分别来自两位甲状腺癌患者的癌组织。其中第一列点阵检测突变型brafv600e基因(图a)，第二列检测野生型brafv600e基因(图b)。通过点阵光学图片可以看出两位患者的组织dna中在含有野生型未突变的brafv600e基因的基础上均检测到了brafv600e基因突变，即突变阳性。
其具体过程参看图1，图1是本发明所述的检测brafv600e基因突变的方法过程示意图，其中a为brafv600e基因探针，b为待测目的基因片段即brafv600e突变基因，c为cy5标记的dna互补链，a、c都是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的dna，b是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的dna或组织提取dna经不对称pcr得到的产物。
序列表
<110>吉林大学
<120>一种检测brafv600e基因突变的方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>15
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
gatttctctgtagct15
<210>2
<211>15
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>2
gatttcactgtagct15
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>3
aggtgattttggtctagctaca22
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>4
ggatccagacaactgttcaaac22
<210>5
<211>15
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>5
ggatccagacaactg15
<210>6
<211>69
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>6
gattttggtctagctacagagaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttg60
tctggatcc69