本发明涉及一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法。
背景技术：
对羟基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid)是一种具有多种用途的有机合成原料，其酯类物质的合成，已在食品药品的防腐杀菌、香精工业、医药合成和农业等领域得到广泛应用。防腐剂方面，对羟基苯甲酸酯(尼泊金酯)是普遍被认可的无刺激安全的化妆品防腐剂；作为食品添加剂，可用于酱油、醋、饮料、果品调味剂、果蔬和腌制品等；亦可用于医药的防腐、防霉和杀菌，是目前应用最广泛的防腐剂之一。香精工业方面，对羟基苯甲酸可用于合成对茴香酸，其酯类呈淡淡的水果及茴香香气，等同天然香料，用于各种香精的配制。药物合成方面，对羟基苯甲酸可用于许多重要药物的合成原料，包括治疗痛风的非布索坦、具有调脂作用的非诺贝特、抗心律失常药胺碘酮和脑功能改善药茴拉西坦等药物的合成。农药合成方面，对羟基苯甲酸可用于除草剂溴苯腈和碘苯腈、杀虫剂杀螟腈和苯腈磷的合成。此外，对羟基苯甲酸还可用于紫外线吸收剂、热敏染料显色剂、彩色胶片、液晶聚合物和塑料的合成。
对羟基苯甲酸的生产方法多种多样，化学法如水杨酸钾加热制取、苯酚钾羧化法、又或者是由异丙苯合成苯酚后，再经高温高压的Kolbe-Schmitt反应合成。其合成工艺存在能源消耗大、成本高、产率低等问题，并且合成途径中产生的苯酚对环境有较大污染。从天然植物中提取，则存在周期长、收率低等缺点。
技术实现要素：
本发明是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法。本发明以一株土壤来源的真菌菌株Gongronella sp.w5为生产菌，从其发酵液中提取分离获得对羟基苯甲酸。该微生物合成法可以在常温常压下进行、并且具有绿色高效等优点。
本发明利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，包括如下步骤：
步骤1：Gongronella sp.w5发酵液的制备
1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronella sp.w5保藏斜面上划出一小菌块(1cm×1cm)接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；
1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块(1cm×1cm)转接到装有100mLⅥ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；
1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％(V/V)的比例接种到装有400mLⅥ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；
步骤2：Gongronella sp.w5发酵液粗提物的制备
将步骤1收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；
步骤3：粗提物的分离
将步骤2获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分4；
步骤4：组分4的分离纯化
将步骤3获得的组分4过ODS反相柱，进行梯度洗脱，获得对羟基苯甲酸(w5-4)。
步骤1中，所述固体CPDA培养基以1L计组成如下：200g土豆滤出液(200g土豆加400mL蒸馏水煮沸30min，过滤)、20g葡萄糖、3.0g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.04g维生素B1以及15g琼脂粉混合均匀后于115℃灭菌30min后获得。
步骤1中，所述Ⅵ液体培养基以1L计组成如下：15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、1.0g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、0.1g十二水磷酸氢二钠、0.01g氯化钙、0.01g七水硫酸亚铁、2mg硫酸锌、2mg五水硫酸铜、0.05mg维生素B1以及28mg腺苷酸混合均匀后于115℃灭菌30min后获得。
步骤1中，所述菌株Gongronella sp.w5是从土壤中分离获得，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2017年12月30日，保藏编号CCTCC NO：M 2017787。步骤3中，梯度洗脱的洗脱参数为：
设置四个洗脱梯度，洗脱液由二氯甲烷和甲醇按照体积比分别为100:1、100:2、100:4、100:8构成，每个梯度洗脱两个柱体积，每100mL为一个流份收集，通过薄层层析检测，相同部分进行合并，得到组分4。
步骤3中硅胶柱进行粗分离的过程具体包括如下步骤：
3a、拌样：将粗提物浸膏和硅胶(200-300目)按1:2的比例进行拌样，自然风干后，研磨成细粉末状待用；
3b、装柱：称10-50倍于上样量的干硅胶(200-300目)，加入干硅胶体积一倍的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后，倒入晾干的玻璃柱中，装上蓄液球，打开柱下活塞，使其自然沉降，将沾于壁上的硅胶用起始洗脱剂轻轻冲洗下去(保证硅胶上表面平整即可)；
3c、压实：沉降完成后，添加更多的二氯甲烷，直至柱床压实(硅胶上表面高度不在下降)；
3d、上样：将以上拌好样的样品缓缓加到压实的硅胶柱上，沿壁缓缓加入一些二氯甲烷，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶上表面，以防止续液时硅胶表面被砸坑；
3e、过柱和收集：以二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱(二氯甲烷：甲醇＝100:1、100:2、100:4、100:8)，每个梯度冲两个柱体积，每100mL为一个流份收集，通过薄层层析进行检测，相同部分进行合并，得到组分4。
步骤4中，梯度洗脱的洗脱参数为：
设置三个洗脱梯度，洗脱液分别为10vt％、15vt％、20vt％的甲醇水溶液，每个梯度洗脱两个柱体积，每100mL收集一个流份，通过薄层层析检测，相同流份进行合并，低温浓缩除去溶剂，即可获得对羟基苯甲酸(w5-4)。
将本发明制得的化合物w5-4低温蒸干后，加入氘代甲醇溶解，以TMS为内标，AM-400型超导核磁共振仪测定化合物w5-4的核磁谱，包括：1H-NMR、13C-NMR、DEPT 135；另将甲醇溶解的样品进行质谱测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、与化学合成法相比，整个反应过程是在常温常压下进行的，污染小、能耗小，并且制备方法简单，不需要酚类物质作为原料。
2、Gongronella sp.w5菌株全基因组已测序，保证了其安全性，为其工业化规模生产奠定了理论基础。
3、目标产物纯度大于98％。
附图说明
图1是组分4过ODS反相柱后的TLC图。
图2是本发明制备的w5-4的MS谱图，图中为ESI电离源负离子模式。
图3是本发明制备的w5-4的核磁共振氢谱图。
图4是本发明制备的w5-4的w5-4的核磁共振碳谱图。
图5是本发明制备的w5-4的核磁共振DEPT135碳谱图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明技术方案作进一步分析说明。
本发明利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法如下：
1、原料的准备
1a、菌株Gongronella sp.w5是从土壤中分离获得，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2017年12月30日，保藏编号CCTCC NO：M2017787。
1b、固体CPDA培养基的制备：将20％土豆滤出液、20g葡萄糖、3.0g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.04g维生素B1以及15g琼脂粉混合均匀，然后于115℃灭菌30min，备用。
1c、所述Ⅵ液体培养基的制备：将15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、1.0g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、0.1g十二水磷酸氢二钠、0.01g氯化钙、0.01g七水硫酸亚铁、2mg硫酸锌、2mg五水硫酸铜、0.05mg维生素B1以及28mg腺苷酸混合均匀，然后于115℃灭菌30min，备用。
2、Gongronella sp.w5发酵液的制备
1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronella sp.w5保藏斜面上划出一小菌块(1cm×1cm)接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；
1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块(1cm×1cm)转接到装有100mLⅥ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；
1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％(V/V)的比例接种到装有400mLⅥ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；
3、Gongronella sp.w5发酵液粗提物的制备
将步骤2收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；
4、粗提物的分离
将步骤3获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分4；
硅胶柱进行粗分离的过程具体包括如下步骤：
4a、拌样：将粗提物浸膏和硅胶(200-300目)按1:2的比例进行拌样，自然风干后，研磨成细粉末状待用；
4b、装柱：称10-50倍于上样量的干硅胶(200-300目)，加入干硅胶体积一倍的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后，倒入晾干的玻璃柱中，装上蓄液球，打开柱下活塞，使其自然沉降，将沾于壁上的硅胶用起始洗脱剂轻轻冲洗下去(保证硅胶上表面平整即可)；
4c、压实：沉降完成后，添加更多的二氯甲烷，直至柱床压实(硅胶上表面高度不在下降)；
4d、上样：将以上拌好样的样品缓缓加到压实的硅胶柱上，沿壁缓缓加入一些二氯甲烷，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶上表面，以防止续液时硅胶表面被砸坑；
4e、过柱和收集：以二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱(二氯甲烷：甲醇＝100:1、100:2、100:4、100:8)，每个梯度冲两个柱体积，每100mL为一个流份收集，通过薄层层析进行检测，相同部分进行合并，得到组分4。
5、组分4的分离纯化
将步骤4获得的组分4过ODS反相柱，进行梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱参数为：
设置三个洗脱梯度，洗脱液分别为10vt％、15vt％、20vt％的甲醇水溶液，每个梯度洗脱两个柱体积，每100mL收集一个流份，通过薄层层析进行检测，相同流份进行合并，低温浓缩除去溶剂，即可获得对羟基苯甲酸(w5-4)。
将本发明制得的化合物w5-4低温蒸干后，加入氘代甲醇溶解，以TMS为内标，AM-400型超导核磁共振仪测定化合物w5-4的核磁谱，包括：1H-NMR、13C-NMR、DEPT 135；另将甲醇溶解的样品进行质谱测定，检测结果见图2-图5。将测定的核磁谱数据和质谱数据与文献进行比对，鉴定该化合物为对羟基苯甲酸，其结构如下：
化合物w5-4的波谱数据：
C7H6O3，negative ESI-MS m/z：137[M-H]-。
1H-NMR(400MHz,MeOD,δin ppm,J in Hz):7.88(2H,d,J＝7.28Hz,H-2,6),6.82(2H,d,J＝7.82Hz,H-3,5)。
13C-NMR(100MHz,MeOD,δin ppm):170.22(COOH),163.49(C-4),133.17(C-2,6),122.90(C-1),116.17(C-3,5)。