一种降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594及其应用的制作方法

文档序号：15234249发布日期：2018-08-21 20:12阅读：248来源：国知局

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594及其应用。

背景技术：

尼古丁（nicotine）、去甲基尼古丁（nornicotine）、假木贼碱（anabasine）、和新烟碱（anatabine）是烟草（nicotianatobacum）中主要的生物碱，其中尼古丁是首要的生物碱，占生物碱总含量的90-95%，去甲基尼古丁含量通常低于总生物碱的3.5%，是尼古丁通过去甲基化反应转化生成。去甲基尼古丁能够对人体健康产生危害，主要表现在它是卷烟烟气中潜在致癌物质亚硝基去甲基尼古丁（nitrosonornicotine,nnn）的合成前体，可能导致食管癌、口腔癌的发生。去甲基尼古丁也能直接诱导吸烟者血浆中蛋白的异常糖基化，也有研究表明它能与常用类固醇类药物发生共价反应，影响药效和毒性。因此，减少尼古丁转化生成去甲基尼古丁，即降低尼古丁转化率是烟草减害的重要目标。

国际上有两种类型的烟草在生产中广泛应用，白肋烟和烤烟，其中白肋烟生产主要在西方发达国家及南美洲，我国主要种植烤烟。白肋烟cyp82e2亚家族的cyp82e4、cyp82e5、cyp82e10基因能够编码具有活性的尼古丁去甲基酶，是尼古丁转化的关键酶。gavilano等通过rnai技术抑制白肋烟强“转化株”cyp82e4及其同源基因的表达，去甲基尼古丁合成受到显著抑制，转基因植株的尼古丁转化率最低只有0.8%，甚至低于白肋烟“非转化株”普遍大约3-5%的转化率。julio等人在1132个ems诱变突变株中筛选得到10株在cyp82e4基因座发生点突变的烟草，其中无义突变及错义突变株中尼古丁转化率降至极其微量水平。lewis等人用ems诱变的方法分别获得了cyp82e4、cyp82e5、cyp82e10发生突变的白肋烟材料，发现cyp82e5、cyp82e10基因突变不影响尼古丁转化率，三个基因同时突变的突变株中尼古丁转化率远远低于对照株。上述研究表明白肋烟中cyp82e4是决定尼古丁转化率的关键基因，cyp82e5、cyp82e10基因无明显影响。

烤烟是中式卷烟的主要原料，降低其尼古丁转化率进而降低nnn含量对中式卷烟减害有重要意义。但迄今为止关于烤烟去甲基尼古丁合成的研究较少，烤烟与白肋烟的合成机制是否一致目前尚无文献报道，如何降低烤烟尼古丁转化率仍需探索。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594；第二目的在于提供所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594相对于核苷酸序列为seqidno.1所示的cyp82e10基因，所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594含有的cyp82e10基因序列中342位的c被t取代发生了点突变，所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594在获得尼古丁低转化率的烟草植株中的应用。

本发明所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594获得的云烟87材料中，叶片尼古丁转化率分别比对照下降约55%，显著降低了尼古丁的转化率。

附图说明

图1为cyp82e10基因突变毛细管电泳检测；

图2为突变体材料m594测序结果比对；

图3为突变体材料的测序峰图；

图4为突变体材料尼古丁转化率分析。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594相对于核苷酸序列为seqidno.1所示的cyp82e10基因，所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594含有的cyp82e10基因序列中342位的c被t取代发生了点突变，所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594的核苷酸序列如seqidno.2所示。

所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594编码的氨基酸序列如seqidno.3所示。

本发明所述降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594的应用为所述的降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594在获得尼古丁低转化率的烟草植株中的应用。

实施例1

烤烟突变体库创制

一、烤烟种子ems处理

烤烟（品种：云烟87）种子用50%的市售商品漂白液浸泡12分钟后，用去离子水快速清洗，并在去离子水中浸泡12小时。弃去离子水，加入等体积0.5%ems（甲基磺酸乙酯）处理12小时。弃处理液，加入去离子水清洗6-8次，每次约1分钟。种子收集于布氏漏斗，抽干待用。

二、m1植株田间种植

ems处理完毕种子播种于漂浮盘，每穴一粒种子，出苗后移栽至田间，正常农艺措施管理。现蕾后单株套袋编号收种获得m2种子。

三、突变体基因组dna提取及混样

利用试剂盒提取基因组dna，步骤如下：

称取0.1g鲜样，液氮研磨、细碎后，转入2.0ml样品管中，立即加入600μlap1缓冲液和4μlrnasea贮存液（100mg/ml）。65℃中水浴处理10分钟，期间颠倒ep管2-3次。加入190μlap2缓冲液，混匀置于冰上5分钟，14000rpm室温离心5分钟。吸取上清液至qiashreddermini柱，14000rpm室温离心2分钟。取450—650μl过滤液至2.0ml离心管中，再加入675-900μl的缓冲液ap3/e。取650μl混合物至2ml的dneasy柱内，室温以≥8000rpm离心1-2分钟。将上述的dneasy柱放入新的2ml收集管中，加入500μlaw缓冲液，以≥8000rpm离心2分钟，丢弃流出液，再用aw缓冲液重复清洗一次。将dneasy柱放在1.5ml离心管中，加入100μlae缓冲液，室温放置5分钟，离心所得滤液即为基因组dna。

大田种植约2200份m2代ems突变体植株，采集叶片并利用上述方法提取基因组dna，将所有样品dna浓度稀释至40ng/μl，最终建立m2代云烟87突变体的dna库，每8份dna混样，构成8倍混合池，保存于96孔板中。

实施例2

cyp82e10基因突变体筛选

一、tilling引物

cyp82e10基因有两个外显子，利用tilling技术筛选第一个外显子区域的突变体。根据目地基因的基因组序列，

正向引物为cyp82e10_tilling_f：gtcaaataccacctcttaatagtaa，

反向引物为cyp82e10_tilling_r：aaaagtccctattggtaggaagtgc。

二、pcr扩增条件

pcr反应体系如下：总体积为10μl，其中20ng/μldna样品1.0μl、10×pcrbuffer1.0μl，dntps0.8μl，引物各0.16μl，taqdna酶0.1μl，ddh2o6.78μl。

pcr反应程序如下：95℃预变性3分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒（每个循环下降1℃），72℃延伸90秒，运行7个循环；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，运行40个循环；最后72℃延伸5分钟。pcr扩增产物可以在4℃保存。

三、pcr产物酶切及电泳

利用celi酶特异性切割异源双链的特性，对pcr产物进行酶切，酶切体系如下：pcr产物4μl，10×buffer1μl，celi酶0.5μl，补充h2o至总体积为10μl。酶切体系利用自动毛细管电泳系统进行分离，分离条件如下：样品上样电压为9kv，上样30sec，marker的上样电压为7.5kv，上样5sec，预电泳电压9kv，分离电泳电压9kv，运行时间80min，电泳结果用prosize2.0软件分析。tilling筛选共获得11个突变株，其中突变单株m594发生l115f突变，结果见表1和图1。

表1云烟87突变体库中cyp82e10基因突变体分析

实施例3

cyp82e10基因错义突变验证

一、m3代突变体基因组dna提取及pcr扩增

根据m2代植株tilling筛选结果，选择cyp82e10基因目标区域发生突变单株的种子（m3代），在育苗盘中播种。采用试剂盒法提取幼苗叶片基因组dna。以cyp82e10_tilling_f和cyp82e10_tilling_r引物，以基因组dna为模板扩增cyp82e10基因第一个外显子区域。pcr反应体系如下：总体积为25μl，其中20ng/μldna样品1.0μl、10×pcrbuffer2.5μl，dntps2μl，引物各0.5μl，taqdna酶0.3μl，ddh2o18.2μl。pcr反应程序如下：95℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒（每个循环下降1℃），72℃延伸90秒，运行30个循环；72℃延伸5分钟。pcr扩增产物可以在4℃保存。

二、pcr产物topo克隆及测序

pcr产物回收后连接ptopo载体（invitrogen），体系如下：pcr产物4μl，pcr-bluntii-topo质粒1μl，saltsolution1μl。反应组分25℃孵育30min，转e.coli.感受态细胞中混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec后立即放入冰浴中2min，加入0.35ml的lb液体培养基，37℃210rpm振荡培养1h。离心1min（7500rpm），弃上清至约100μl混匀，均匀涂布于km抗性培养基上，37℃过夜培养。选择阳性克隆提取质粒后进行sanger测序，结果见图2和图3。

实施例4

cyp82e10基因错义突变体尼古丁转化率分析

一、突变体材料样品制备

烟草生长至成熟期，取整株烟叶样品60℃烘干，粉碎过60目筛待测。准确称取烟样0.5g于50ml离心管中，加入5ml10%的naoh溶液，摇匀，浸泡15min，加入20ml含内标的萃取液，超声60min，在离心机上5000r/min离心5min，取2ml下层二氯甲烷清液过装有2g无水硫酸钠的微孔过滤器后，用气相色谱-串联质谱仪分析。

二、叶片去甲基尼古丁含量分析

采用gc-ms-ms法分析叶片中去甲基尼古丁含量。传输线温度：230℃，离子源温度：210℃；电离模式：电子轰击电离（ei）；轰击能量：70ev；灯丝电流：50μa，电子倍增器电压1200v；碰撞气：氩气（纯度≥99.999％）；碰撞池压力：0.3pa）；溶剂延迟时间：4min；数据采集模式：mrm。保留时间（min）：10.48；定量离子对：119﹥92；碰撞能(ev)：15；定性离子对：119﹥65；碰撞能(ev)：25；驻留时间(s)：0.15。m4代植株中，m594材料尼古丁转化率是云烟87的45%。尼古丁转化率＝[去甲基尼古丁/去甲基尼古丁＋尼古丁]*100%，具体结果见图4。

sequencelisting

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>一种降低尼古丁转化率的cyp82e10基因错义突变体m594及其应用

<130>2018

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1554

<212>dna

<213>cyp82e10基因

<400>1

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<210>2