本发明属于基因工程领域，具体涉及一种玉米耐逆相关转录因子zmnac33基因及其应用。
背景技术：
植物在生长过程中常常遭受到各种逆境影响因子，包括干旱、高盐、低温和病虫。由于环境因素影响着植物的生长，植物进化出各种机制来应对这些挑战。植物应对干旱和高盐的复杂调控过程涉及渗透保护物质的合成、离子调节和质膜保护等各个方面，而这些胁迫相关基因的表达离不开植物体内各类转录因子的有效调控。转录因子通过与基因启动子和增强子的dna顺式元件相互作用，直接或间接来调节靶基因的转录和表达。植物的抗逆性状是受多基因控制的数量性状，转录因子可以调控多个与抗逆性状相关的基因表达，并通过增强某些关键调节因子的作用来促进这些抗逆基因发挥相应的作用，使植株的抗逆性得到改善。研究发现，nac蛋白参与到植物中的非生物胁迫的逆境响应中，如冻害、干旱胁迫、高盐等多种非生物胁迫，nac诱导了许多胁迫相关基因的表达从而调控植株对逆境胁迫的反应。
研究表明，干旱、高盐等逆境胁迫或脱落酸能诱导水稻snac1、osnac6/snac2、osnac5、osnac10、osnac45、玉米zmsnac1、zmnac111、zmnac55、拟南芥ataf1、anac019、anac055和anac072等nac转录因子基因的表达，而且功能研究也证明这些nac基因在耐逆、耐盐反应中具有作用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种新的玉米耐逆相关转录因子基因，增强植物的耐旱能力。
本发明的技术方案为：玉米耐逆相关转录因子zmnac33基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
玉米耐逆相关转录因子zmnac33编码的蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。
玉米耐逆相关转录因子zmnac33基因或玉米耐逆相关转录因子zmnac33编码的蛋白在增强植物耐逆能力上的应用。
进一步地，增强植物耐逆能力是指增强植物耐旱能力。
进一步地，所述植物为双子叶植物。
本发明从耐逆玉米自交系中克隆到的一个转录调控因子zmnac33，zmnac33与zmnac55和zmnac111都存在nac结构域，它们属于同一个nac家族，zmnac33与zmnac55在蛋白序列上相似度为28.71％，zmnac33与zmnac111在蛋白序列上相似度为24.75％。干旱胁迫下，zmnac33基因表达上调。构建zmnac33双子叶植物双元载体，通过蘸花法将zmnac33基因导入拟南芥中，收获的种子经过潮霉素筛选和pcr鉴定，得到纯合株系。转基因苗经过干旱胁迫、种子萌发率等手段，得到了能显著增强拟南芥抗旱能力的转基因株系。这说明zmnac33能增强植物对耐逆胁迫的耐受能力，具有重要意义。
附图说明
图1为双子叶植物双元载体zmnac33-pgreen载体上的zmnac33基因构建示意图(zmnac33：目的基因；pcambia1300super-gfp：双子叶植物双元载体)；
图2为pcr鉴定转基因拟南芥zmnac33基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中出现约880bp的zmnac33基因条带，野生型拟南芥的基因组dna为阴性对象进行pcr鉴定，未出现880bp的zmnac33基因条带；wt：野生型拟南芥pcr扩增产物；l1-l12：转基因zmnac33拟南芥pcr扩增图；
图3为转基因拟南芥种子萌发率测定，wt：野生型拟南芥；l2：zmnac33转基因拟南芥株系l2；野生型拟南芥种子和zmnac33转基因拟南芥株系l2播种在含有350mm甘露醇的1/2ms培养基上，测定种子的萌发率；
图4为转基因拟南芥幼苗胁迫处理，wt：野生型拟南芥；l2、l3、l13：分别为zmnac33转基因拟南芥株系l2、l3、l13；生长5天的野生型拟南芥和zmnac33转基因拟南芥株系l2、l3和l13移苗到含有400mm甘露醇的1/2ms培养基上测定生长情况；
图5为转基因拟南芥干旱胁迫处理，wt：野生型拟南芥；l2、l3：分别为zmnac33转基因拟南芥株系l2、l3。野生型拟南芥和zmnac33转基因拟南芥株系l2、l3种植于营养土中，进行干旱胁迫处理，测定转基因植株的耐旱能力。
具体实施方式
实施例1：玉米耐逆转录因子zmnac33基因克隆和双子叶植物双元载体构建
根据实验前期对玉米耐旱qtl的定位，在候选qtl区域找到一个与耐逆相关的转录因子zmnac33；参考玉米基因组数据库的基因序列，设计用于构建双子叶植物双元载体的引物序列。上游引物f1:5’-ccaagcttatgagcggcgccggtccggatc-3’(seqidno.3)，下游引物r1:5’-tcccccgggtgaacggcttgccccagtacatgag-3’(seqidno.4)，pcr产物为897bp。提取用蛭石培养至三叶一心期的耐逆玉米自交系的总rna，用oligo(dt)18为引物进行反转录，得到玉米自交系的cdna。用此cdna作为模板。引物f1和r1进行pcr扩增基因。琼脂糖凝胶电泳回收pcr产物，用限制性内切酶hindiii和xmai酶切回收的目的片段和双子叶植物双元载体，然后用回收试剂盒回收酶切产物。
用t4dna连接酶连接回收的目的片段和双元载体，25℃连接1小时。连接产物转化e.colidh5α，用引物f1和r1进行pcr鉴定转化平板上的菌落，得到约897bp的条带。挑取含有目的条带的克隆送样测序。选择测序结果正确的菌落，提取质粒，完成了zmnac33基因的双子叶植物双元质粒的构建(zmnac33-pgreen，t-dna示意图见图1。用化学转化法把该双元质粒转化农杆菌gv3101，获得了工程农杆菌gv3101：：zmnac33-pgreen，可以用于植物转化。
实施例2：zmnac33基因的拟南芥转化
用gv3101：：zmnac33-pgreen侵染拟南芥的步骤如下：
(1)农杆菌的培养：从平板上挑取含有zmnac33目的基因的农杆菌gv3101，接种于含有50mg/l利福平、50mg/l卡那霉素的yeb液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。按1:100比例，取过夜培养的农杆菌1ml接种于新的100ml液体yeb培养基中，继续振荡培养9h。用离心管离心收集菌体。室温，4000g离心10min，弃上清，倒置离心管，让残余液体流尽。
(2)农杆菌侵染拟南芥：在拟南芥出现花蕾时，用剪子把拟南芥的顶端剪去，以促进拟南芥分化更多侧枝，增加更多的花蕾。在剪去顶端1周后，准备用农杆菌侵染拟南芥，用剪子把已经长成的长角果剪去。用含有5％蔗糖的1/2ms液体培养基重悬农杆菌，稀释至od600＝0.8，悬浮液中加入终浓度为0.04％的sliwetl-77表面活性剂。将悬浮液倒入小烧杯中，将拟南芥倒置，使花序浸入含有农杆菌的悬浮液中，大约1min，期间不断搅动菌液。浸染结束后，用黑色塑料袋把拟南芥套在里面，黑暗培养24h。暗培养后，将拟南芥置于正常光照条件下培养。隔4天再侵染一次，共计侵染3次。待种子成熟后，收集种子。
(3)转基因分子检测：将收获的拟南芥种子经过种子表面消毒后，播种在含有50mg/l潮霉素的1/2ms培养基平板上，先4℃处理2天，然后光照培养7天。挑选能够正常生长的拟南芥苗，将存活的拟南芥移栽到基质中培养。对存活的拟南芥进行pcr鉴定，剪下拟南芥的一片叶子；用ctab法提取基因组dna，用引物f1和r1进行pcr鉴定，用野生型拟南芥的基因组dna作为阴性对照，同时进行pcr扩增。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，野生型拟南芥未出现目的基因条带，转基因株系出现目的基因条带(见图2)。待阳性苗的种子成熟后，单株收集种子。收集的种子再次播种于含有潮霉素的1/2ms培养基上进行筛选，再次对存活的植株进行pcr鉴定。最后，收集成熟的种子。
实施例3：转zmnac33基因拟南芥的耐旱性鉴定
种子萌发率：把野生型拟南芥和转基因拟南芥播种在含有350mm甘露醇的1/2ms培养基平板上，每份株系播种50粒种子，重复3次。平板放在4℃低温处理2天，转移至培养室培养7天，照相(见图3)。与野生型拟南芥比较，转基因植株萌发的种子数比野生型多，表明zmnac33转基因植株种子萌发时耐旱。
幼苗胁迫处理：选择培养5天的拟南芥幼苗，移到含有400mm甘露醇的1/2ms的培养基平板上，垂直培养10天(图4)。与野生型拟南芥比较，转基因拟南芥根长比野生型长，表明zmnac33转拟南芥植株能够增强拟南芥的耐旱能力。
干旱处理：将t3代转基因拟南芥种于基质中，正常生长4周后，停止浇水，3周后，野生型拟南芥叶片出现萎蔫，；转基因拟南芥植株叶片仍然保持绿色，仍能继续生长(图5)，表明zmnac33能够增强拟南芥的耐旱能力。
序列表
<110>申请人名称:吉林省农业科学院
<120>玉米耐逆相关转录因子zmnac33基因及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>882
<212>dna
<213>玉米(zeamays)
<400>1
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