本发明涉及肿瘤分子生物学，特别是一种胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3及其应用。
背景技术：
胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，其发病隐匿、进展迅速、手术切除率低、放化疗效果不佳，预后极差，总体5年生存率不到5％，在全球癌症发病率中占第13位，排在所有恶性肿瘤致死原因的第四位。大多数的胰腺癌患者往往确诊时已出现淋巴或血运转移，从而失去了根治性手术治疗的机会。胰腺癌患者死亡的主要原因是肿瘤早期即发生局部侵袭或远处转移，也是制约患者预后的主要因素。目前胰腺癌的侵袭转移机制尚不明确，了解胰腺癌的恶性生物学行为发生机制，并给予适当的干预措施，对于提高胰腺癌的临床诊治水平并改善患者的预后具有十分重要的现实意义。目前，临床上还没有理想的分子指标来评估预后及发生转移的风险。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。
长链非编码rna是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白质的rna。长链非编码rna参与细胞各种生命活动的不同阶段，差不多涉及生命周期中的每一步反应，例如基因转录、mrna的剪接、rna衰变及翻译等。在一些复杂的疾病中，相关的信号通常来源于基因组的非编码区域，越来越多的研究也表明，长链非编码rna的异常表达与人类重大疾病相关联。另外，越来越多的研究结果发现，众多长链非编码rna参与到了癌症的发生发展中。目前，已研究证实异常表达的长链非编码rna，在众多恶性肿瘤中都存在，有的显著上调，有的显著下调。其中代表性的研究在乳腺癌，肝癌、和前列腺癌中均有发现。长链非编码rna的研究具有很重要的研究价值，特别是在临床研究上和药物开发上，它不仅可以为众多疾病的研究，包括肿瘤及心血管疾病，以及另一些目前很难治疗的疾病提供新的依据和靶点，而且有助于人们认识复杂的生命调控过程。对长链非编码rna研究将会是未来生命科学领域的重心与焦点，有助于更透彻地了解人类重大疾病的发病机理，为疾病的早期诊断和及时治疗提供生物标记以及相应的药物作用靶点。lnc-clec18b-3是一种新发现的非编码rna，其转录本长度大于200个核苷酸。目前，非编码rnalnc-clec18b-3在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。lnc-clec18b-3是否可以作为一种新的肿瘤标志物制备试剂及试剂盒，应用于预测胰腺癌患者预后至今未见有公开报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3及其应用，可有效解决制备预测胰腺癌患者预后的试剂盒的问题。
本发明解决的技术方案是，一种胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3，其转录本长度大于200个核苷酸，序列为seqno:1；
该胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3在制备胰腺癌预后实时荧光定量pcr检测试剂盒中的应用；
所述的胰腺癌预后实时荧光定量pcr检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为seqno：2和3、内参基因tuba1a表达的引物序列，引物序列为seqno：4、5和从胰腺癌组织中提取rna，并进行逆转录及荧光定量pcr的试剂。
本发明lnc-clec18b-3是一种新发现的非编码rna，可有效用于制备胰腺癌患者预后的试剂盒，非编码rnalnc-clec18b-3作为胰腺癌预后新的分子标志物，可及时预测胰腺癌预后，并及时对胰腺癌患者进行治疗，延长患者生存时间，提高生存率，是胰腺癌预后上的一大创新，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明实时荧光定量pcr分析lnc-clec18b-3在正常组织与胰腺癌中的表达差异图。
图2为本发明对胰腺癌患者的预后影响生存曲线分析胰腺癌组织来源的lnc-clec18b-3表达高低图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3，为新发现的一种非编码rnalnc-clec18b-3分子标志物，为长链非编码rna，其转录本长度大于200个核苷酸，该核苷酸序列为seqno：1：
seqno:1
gcggcgggcccggatcttcgccaccgccgtcatttgtgggcggagaaagggctggagaaaggcgggaatcgcccctcgtccctcgccgtgcgtttccctggacttaagggccgaagggacaccggcgacttgacctcctggtattggcctgtaccgtcacctgcagaggcttttcgcctcaattccttcccagcaccctccccccgccacccccccaaagtaaatagttgacagtttacttttctaccacccggaagaagttcacttttgcttcaggtcaaaatcctccgcgatttctgagaggaactttaaatctctaacataagagcacgcttttaatgtaatttgattgcagggagaggctcctccgtgctcctgagaggccgaacacagggtcgccagcacagcttactgctcgg419
该胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3在制备胰腺癌预后实时荧光定量pcr检测试剂盒中的应用；
所述的胰腺癌预后实时荧光定量pcr检测试剂盒包括置于盒体内的用于检测胰腺癌患者预后的试剂盒表达的特异性引物，引物序列为seqno：2和3、内参基因tuba1a表达的引物序列，引物序列为seqno：4、5和从胰腺癌组织中提取rna，并进行逆转录及荧光定量pcr的试剂，其中：
seqno:2
atcttcgccaccgccgtc
seqno:3
cagtaagctgtgctggcga
seqno:4
ggagctctactgcctggaac
seqno:5
agagaacctgcggcacatag
所述的检测胰腺癌组织中lnc-clec18b-3表达量的试剂盒为实时荧光定pcr检测试剂盒。
所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒包括进行实时荧光定量pcr的特异性引物，包括用于检测lnc-clec18b-3表达的特异性引物，引物序列为seqno:2、3，以及内参基因tuba1a表达的引物序列，引物序列为seqno:4、5。
所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒，除lnc-clec18b-3的引物外，还含有从胰腺癌组织中提取rna并进行逆转录及荧光定量pcr的所有试剂。包括：
(1)从胰腺癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总rna所用试剂，包括trizol液、氯仿、异丙醇、抑制rna降解溶剂、75％乙醇，depc水；
(2)以总rna为模板将lnc-clec18b-3逆转录为cdna所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dntp、逆转录酶m-mlv以及随机引物和oligodt引物的混合物；
(3)将cdna实时定量pcr所用试剂，包括lnc-clec18b-3实时荧光定量pcr特异性引物、tuba1a内参特异性pcr引物、实时荧光定量sybr染料、无rna酶的水。
本发明通过荧光定量pcr与生存曲线分析发现胰腺癌组织来源的lnc-clec18b-3与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高。此法为预测胰腺癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高胰腺癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。并经实地试验，取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：
实施例1
制备检测lnc-clec18b-3表达量的试剂用于制备胰腺癌患者预后的试剂盒(用于30次反应)
1.trizol20ml
2.抑制rna降解溶剂40ml
3.氯仿80ml
4.异丙醇80ml
5.depc水10ml
6.10×随机引物和oligodt引物的混合物100μl
7.5×逆转录反应缓冲液150μl
8.10mm含mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dntp100μl
9.200u/μlm-mlv逆转录酶50μl
10.sybrgreenqpcrmix500μl
11.3μm目的基因lnc-clec18b-3特异性引物（其序列如seqno:2、3所示）50μl
12.3μm内参基因tuba1a特异性引物（其序列如seqno:4、5所示）50μl
实施例2组织样本lnc-clec18b-3的检测
1、收集待测胰腺癌或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制rna降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。
2、组织中rna的抽提：
（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的trizol液的ep管中。组织粉末总体积不能超过所用trizol体积的10%，充分混合均匀。
（2）室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，盖紧ep管并剧烈摇荡0.5分钟。12000转/分钟离心10分钟。
（3）取上层水相于一新的ep管中（勿中间的沉淀层和下层液混入），加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。
（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟。重复操作一次。
（5）弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10分钟（注意不要干燥过分，否则会降低rna的溶解度）。用50μldepc处理过的水将rna溶解。
（6）rna浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μlrna样品加至样品孔，根据读数直接确定rna的浓度。核酸浓度测定仪的测定的od260/od280比值，比值在1.8-2.0之间认为rna纯度很好。最后，rna贮存于-80℃冰箱备用。
3、lnc-clec18b-3rna的逆转录：使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒（d7170s）。具体步骤如下。
（1）去除基因组dna：将模板totalrna，5×gdnaeraserbuffer在冰上解冻，5×rtbuffer、10×rtprimermix、depc-treatedwater在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。rna的变性，把rna样品在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰水中冷却。按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入rna样品。
（2）在pcr仪上或水浴中，37℃孵育2分钟。迅速置于冰上放置备用。
（3）逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应。按照下表的逆转录反应体系配制混合液。
（4）42℃孵育60分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10分钟失活逆转录酶后放于冰上。对于二级结构复杂或高gc含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率。
（5）得到的cdna可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量pcr，cdna宜避免过多的反复冻融。
4、利用lnc-clec18b-3的特异性引物进行实时定量pcr：特异性引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测lnc-clec18b-3表达的特异性引物，引物序列为seqno:2、3，以及内参基因tuba1a表达的引物序列，引物序列为seqno:4、5。实时定量pcr其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的beyofast™sybrgreenqpcrmix(2×)，具体步骤如下：
（1）融解并混匀pcr反应所需的各种溶液，beyofast™sybrgreenqpcrmix完全融解并混匀后置于冰盒内。
（2）冰浴上设置pcr反应体系(以96孔板为例)：
(3)通常dna模板的量以1-10ngcdna为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μm时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度。如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录pcr反应得到的cdna直接作为模板时，其添加量不要超过pcr反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。
(4)用移液器轻轻吹打混匀或轻微vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
(5)将设置好的pcr反应管或pcr反应板置于荧光定量pcr仪上，开始pcr反应。
(6)pcr反应程序：在实时荧光定量pcr反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃2分钟。采用如下的pcr程序，本程序是以abi7900ht荧光定量pcr仪为例：
a.预变性：95℃2min
b.变性：95℃15sec
c.退火/延伸：60℃15-30sec
d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环
e.熔解曲线分析(可选)：95℃15sec,60℃15sec,95℃15sec
f.使用荧光定量pcr仪提供的软件分析结果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。
5、lnc-clec18b-3表达量的数据分析：本实验数据纳入60例胰腺癌患者及其正常对照组织。实时定量pcr的结果分析采用相对定量方法即2^-△△ct法。具体如下：首先，将一次实验的所有基因ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因lnc-clec18b-3的ct值减去自身内参基因tuba1a的ct值，得到的数就是△ct；换成公式就是：△ct=ct（目的基因lnc-clec18b-3）-ct（内参基因tuba1a）；然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因lnc-clec18b-3的△ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的△ct减去正常对照组织组样本的△ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△ct。最后，对-△△ct进行2的幂运算，即2^-△△ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。胰腺癌的肿瘤组织中lnc-clec18b-3的表达量比正常对照高（见图1），差异具有统计学差异(p＜0.05)。
6、通过对上述实验所纳入的60例胰腺癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的胰腺癌患者中，选取荧光实时定量pcr分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较。肿瘤组织中lnc-clec18b-3表达高于正常对照组织的患者定义为lnc-clec18b-3高表达组，其余为低表达组。通过kaplan-meier生存分析，lnc-clec18b-3高表达患者的生存期比lnc-clec18b-3低表达组的患者明显降低，预后更差（见图2），差异具有有统计学意义(p＜0.05)。因此，lnc-clec18b-3可作为胰腺癌患者预后的特异性分子标志物。
由以上可以清楚的看出，本发明公开了一种新的胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3，用于制备胰腺癌患者的试剂盒，通过检测胰腺癌肿瘤组织来源的lnc-clec18b-3的试剂盒。通过研究证实lnc-cit-1在胰腺癌中表达上调，高表达lnc-clec18b-3的胰腺癌患者，其总体生存率更差。因此，通过检测胰腺癌患者肿瘤组织中lnc-clec18b-3的表达水平，可以对胰腺癌患者做出预后检查诊断，准确率高达96%以上，并进行及时治疗，提高患者生存率和生存质量，具有深远的临床应用意义和推广应用价值，经济和社会效益巨大。
序列表
<110>郑州大学第一附属医院
<120>一种胰腺癌预后分子标志物非编码rnalnc-clec18b-3及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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accggcgacttgacctcctggtattggcctgtaccgtcacctgcagaggcttttcgcctc180
aattccttcccagcaccctccccccgccacccccccaaagtaaatagttgacagtttact240
tttctaccacccggaagaagttcacttttgcttcaggtcaaaatcctccgcgatttctga300
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