本发明涉及自主设计并合成新的的达卡巴嗪衍生物(der)，具体涉及本衍生物对山梨醇脱氢酶(sdh)的抑制作用将明显高于达卡巴嗪(da-c)，致使鳞翅目昆虫体内山梨醇脱氢酶活性降低，从而阻碍鳞翅目昆虫的发育，创新鳞翅目害虫的杀虫剂的开发。
背景技术：
衍生物(derivative)是指较简单的化合物所含的原子或原子团被其他原子或原子团置换而生成的较复杂的化合物。通过制备抑制剂的衍生物可以使小分子抑制剂与受体蛋白的活性位点更好的结合，从而加强抑制能力。
山梨醇脱氢酶(sdh)是一种广泛存在于动物、植物和微生物的mdr超家族中alcoholdehydrogenase(adh)家族中的一员。sdh是多元醇代谢通路中的关键酶，近些年来的研究主要集中于哺乳动物肝脏和昆虫等滞育生物的休眠体中。在本专利的前期研究中发现，sdh在柞蚕的滞育蛹中的活性变化对柞蚕解除滞育的过程起到关键性的作用。因此，发明出新型的sdh抑制剂对控制鳞翅目昆虫生长发育有着至关重要的意义。
sdh的催化反应机制为zinc原子首先与三条蛋白侧链和一个水分子结合，其过程需要nad+作为辅助因子，然后四聚体的主链和侧链改变空间构象并结合山梨醇。山梨醇骨架c1和c2位置上的氧原子与zinc结合同时释放亚基中glu70并且使zinc变成zinc5+。此时山梨醇碳骨架后侧出c3-c5位置碳链构象改变成果糖的构象，并局部堆积在烟酰胺环处。此后的氧化步骤为水分子为氧化酶中的gly155和复合体中的gly155、gly70提供氢键，并从zinc结合的c2处的羟基上脱掉一个质子从而引起串联反应。c2处的氢结合nad+并放出电子，使其还原成nadh，同时氧化c2处羟基成为果糖酮羰基完成氧化。在产物果糖的释放过程中，因为在正向产生的果糖正好阻碍了nadh从蛋白上释放的通道，所以果糖将首先释放，然后释放nadh并伴随着催化zinc附近的残基回归到原来位置和催化前四聚体结构的形成，完成整体催化过程。
目前只有一种被证实的sdh活性抑制剂，哌嗪嘧啶，在烟酸己可碱中被发现。sorbitoldehydrogenaseinhibitor157(sdi)最初被描述为是山梨醇积累复合物，其作用是sdh特异性抑制剂cp-166，572的前体药物。sdi-157与cp-166，572之间的作用很典型，sdh-157嘧啶环中的甲基羟基化使得cp-166,572的ic50急剧下降。当cp-166,572抑制sdh时，其不与nad+、山梨醇或者nadh竞争，而是与sdh-nadh复合体结合，使其无法释放产物果糖。
sdh/nadh/cp-166,572复合物的晶体结构显示cp-166,572的嘧啶环恰好与zinc原子和nadh接触，同时哌嗪环扩张到蛋白表面。cp-166,572通过其羟甲基上的n1氮原子和o30氧原子螯合催化的zinc原子达到抑制基质的作用。其嘧啶环在nadh的烟酰胺环上堆积形成紧密的疏水键，此种结合异常紧密。cp-166,572还会改变与催化zinc结合的氨基酸残基，glu70被取代后与水分子形成氢键。cp-166,572中嘧啶环上的n1氮原子和o30氧取代水分子与zinc原子螯合。同时，蛋白的第42-46位残基的主链和侧链也有很明显的变化，其中最显著的是cys44的侧链，经过旋转保持着与sγ和zinc原子的最远位置。zinc原子与羟甲基上的氧之间的结合力取决于氧贡献电子的能力，决定电子去向和释放能力则取决于氢与其他原子的相互作用。可以形成氢键的位置主要集中在氧原子和his69、glu155处，因为his69是zinc配体，而glu155是潜在的氢键受体。当氢结合到其他原子上时氧就会释放一对自由电子并结合zinc原子。除了o30氧以外，cp-166,572上再没有其他与sdh蛋白直接通过氢键连接的位点。不过存在一种可能的连接通过水分子上的氢键使嘧啶环上的n3氮与arg298的觚盐连接。
sdh的活性变化与鳞翅目昆虫生长发育有着密切关系，通过体外手段抑制sdh活性，将有望调节这些生理过程。目前，可以通过核酸干扰、多肽类抑制剂以及小分子抑制剂等手段抑制sdh活性。相比于核酸类、多肽类抑制剂，小分子抑制剂具有分子量低、膜透过性强等优势，更容易在体内发挥药学活性。而且，sdh小分子抑制剂相对低的成本，也使其成为经济上有利的抑制剂。且小分子模拟物有利于作为研究工具，揭示细胞内和体内蛋白相互作用网络调控机制。因此，寻找抑制能力强、选择性优、细胞透过性好、细胞毒性小的小分子抑制剂势在必行。
技术实现要素：
本发明的是发现一种达卡巴嗪(da-c)衍生物(der)、制备方法及新用途。
本发明的技术方案：
一种达卡巴嗪衍生物，所述的达卡巴嗪衍生物为用哌啶取代达卡巴嗪5'位3,3-二甲基，其结构式为：
其中，r为哌啶环。
一种达卡巴嗪衍生物的制备方法，合成路线如下：
步骤如下：
将5-氨基-4-咪唑甲酰胺加入至1mol/l的稀盐酸中，使5-氨基-4-咪唑甲酰胺在稀盐酸中的浓度为2～2.5mmol/ml，形成溶液a；再将nano2溶于水，逐滴缓慢加入至溶液a中，nano2在混合溶液中的浓度为3～3.5mmol/ml；在冰浴条件下，混合溶液搅拌反应10～30min，期间反应体系封闭并不断注入氮气；用淀粉碘化钾试纸检测确定反应过程亚硝酸钠过量，此时混合溶液变成深红色，随后将哌啶逐滴缓慢加入混合溶液中，使哌啶在混合溶液中的浓度为2.2～2.8mmol/ml；搅拌均匀后少量逐次加入na2co3调节反应液ph值至10～11，继续在冰浴条件下搅拌反应0.5～1h；反应结束后用正丁醇萃取反应液三次，并利用无水mgso4去除反应中的水；将产物真空干燥后，利用氢谱和质谱鉴定合成产物，即为达卡巴嗪衍生物。
一种达卡巴嗪衍生物的新用途，所述的达卡巴嗪衍生物作为鳞翅昆虫山梨醇脱氢酶蛋白活性抑制剂，达卡巴嗪衍生物作用受体为鳞翅昆虫山梨醇脱氢酶，其与鳞翅昆虫山梨醇脱氢酶的活性位点cys41紧密结合，使其抑制活性能力加强，可以有效抑制鳞翅目昆虫的变态发育。
达卡巴嗪衍生物具有低细胞毒性，可以证明其在抑制山梨醇脱氢酶活性时是由于其与山梨醇脱氢酶活性位点结合从而抑制山梨醇脱氢酶活性，而不是其毒性对山梨醇脱氢酶的活性造成影响。
所述的达卡巴嗪衍生物作为杀虫剂用于鳞翅昆虫目害虫的防治。
本发明的有益效果：达卡巴嗪衍生物对山梨醇脱氢酶结构的预测以及通过分子对接技术筛选出具有高效的、特异性的小分子抑制剂-达卡巴嗪衍生物，使其与受体蛋白的活性位点结合更紧密。
附图说明
图1为der的氢谱检测图。
图2为der的质谱检测图
图3为检测抑制剂的ic50值。
图4为抑制剂浓度处于ic50值时的sdh酶活检测。
图5为不同浓度的底物和不同浓度的抑制剂的条件下sdh的酶活检测。
图6为最大浓度抑制剂的体系稀释1000倍的酶活检测。
图7为体内条件下der对柞蚕蛹发育影响作用。
图8(a)为der对昆虫sf9细胞作用24小时的细胞毒性。
图8(b)为der对昆虫sf9细胞作用48小时的细胞毒性。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例
合成达卡巴嗪衍生物der，具体操作如下：
取5-氨基-4-咪唑甲酰胺250mg加入至2ml1mol/l的稀盐酸中，再取0.1175gnano2加入至3ml水中，将二者置于圆底烧瓶中在冰浴状态下搅拌反应10min，期间翻口胶塞封闭并不断注入氮气。用淀粉碘化钾试纸检测确定反应过程亚硝酸钠过量，此时反应液变成深红色，随后取152μl哌啶加入反应液中；少量逐次加入na2co3调节反应液ph值至10～11，继续在冰上搅拌反应1h。反应结束后用正丁醇萃取三次，并利用无水mgso4去水。将产物真空干燥后，利用氢谱和质谱鉴定合成产物(图1、2)。
应用例
根据山梨醇脱氢酶活性检测试剂盒，取柞蚕组织制成粗酶液进行活性检测，具体步骤如下：
①粗酶液提取：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5的比例，称取0.1g柞蚕脂肪体，加入1ml提取液，进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
②测定步骤：
i.分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
ii.样本测定：试剂一：400μl；试剂二：300μl；试剂三：300μl；三者按剂量混匀，25℃水浴5min；添加50μl的粗酶液和0-100μm的da-c；
将上述试剂按顺序加1ml玻璃比色皿中，加样本的同时开始计时，记录20秒时的初始吸光度a1和2分20秒时的吸光度a2，计算δa＝a2-a1。
iii.sdh活性计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmolnadh定义为一个酶活力单位。
sdh(nmol/min/mgprot)＝[δa×v反总÷(ε×d)×109]÷(v样×cpr)÷t＝1688×δa÷cpr
其中：v反总：反应体系总体积，1.05×10-3l；ε：nadh摩尔消光系数，6.22×103l/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；v样：加入样本体积，0.05ml；v样总：加入提取液体积，1ml；t反应时间，2min；cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml)，用蛋白抑制率对化合物剂量对数作图求出ic50值，结果如图3示。
由于der为dmso所溶解，按照上述方法检测抑制剂浓度为ic50值，即11.22μm时sdh的活性与只加了相同浓度dmso的对照组相比(图4)。
为了确定der对sdh酶活性的抑制方式，分别在底物浓度为1、2、3、4μg/μl，抑制剂浓度分别为0、10、50、100μm时检测sdh酶活，方法同上。利用lineweaver-burk双倒数法作图，若所作直线呈平行状态，且不过原点，说明der对sdh的活性抑制的抑制方式为不可逆抑制(图5)；若所作直线相交于原点，则为可逆抑制。
为了验证der对sdh酶活性的抑制方式是否为不可逆反应，将最大抑制剂浓度和最大底物浓度体系稀释1000倍，检测此刻sdh酶活，与未稀释组相比，若结果并未有明显差异，则证明der对sdh的活性抑制的抑制方式为不可逆抑制(图6)；反之，则不能证明不可逆抑制。
为了验证在体内条件下，der是否可以抑制柞蚕蛹体内sdh活性从而影响滞育的柞蚕蛹的发育。每组取6只发育状态相同、个头大小相似的滞育状态的柞蚕蛹，分别向柞蚕蛹体内注射dmso、20μgder、40μgder、60μgder、80μgder和100μgder，置于室温下观测其状态。从注射后23天起，陆续有蛾从柞蚕蛹中羽化蜕皮出来，正常组及dmso组的柞蚕蛹优先发育，抑制剂浓度越高的柞蚕蛹越不容易发育。
作图，横轴为记录蚕蛹出蛾的天数，纵轴为蚕蛹出蛾的个数，可以明显看出空白对照组与dmso组与注射了抑制剂的各个实验组有明显差异(图7)。
达卡巴嗪作为已经临床使用的抗癌药物，其细胞毒性理应较低，为了检测其衍生物der的细胞毒性，采用日本同仁cck-8试剂盒检测der对昆虫sf9细胞的细胞毒性，具体操作：
①在96孔板各孔中加入100μl细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24h(在27℃，无c02的条件下)。
②向培养板中加入10μl不同浓度的der(5、10、20、50、100μm)。
③将培养板在培养箱中孵育6h。
④向每孔加入10μlcck-8溶液。
⑤将培养板在培养箱内分别孵育24h(图8a)和48h(图8b)，用酶标仪测定在450nm出的吸光度。