本发明属于分子生物学dna标记
技术领域：
，具体涉及短体副鳅微卫星位点及其引物和应用。
背景技术：
：微卫星dna：又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以1～6个碱基的短核苷酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计一对特异性引物，通过pcr技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于pcr扩增，所需dna数量极少，对dna质量要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。短体副鳅(paracobitispotanini)，别名包氏条鳅、钢鳅，隶属于鲤形目鳅科(cobitidae)条鳅亚科(noemacheilinae)副鳅属(paracobitis)，主要分布在长江上游干流以及三峡库区的一些支流，如香溪、龙船河、大宁河、乌江等天然水域，秦岭南部也有分布，是长江上游特有鱼类。短体副鳅个体小，常见个体体长45～96mm，短体副鳅体色鲜艳，全身布满漂亮的花纹，具有极高的观赏价值。近年来，由于酷渔滥捕以及挖沙船等对鱼类三场的破坏等原因，资源量急剧下降。技术实现要素：本发明的目的在于提供了7个短体副鳅的微卫星位点及其引物和应用。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：短体副鳅的微卫星位点，包括7个微卫星位点，其核酸序列如seqidno：1～7所示。用于扩增上述7个短体副鳅微卫星位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno：8～21所示；其中，用于扩增序列为seqidno：1的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为seqidno:8、seqidno：9；用于扩增序列为seqidno：2的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为seqidno：10、seqidno：11；用于扩增序列为seqidno：3的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为seqidno：12、seqidno：13；用于扩增序列为seqidno：4的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为seqidno：14、seqidno：15；用于扩增序列为seqidno：5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为seqidno：16、seqidno：17；用于扩增序列为seqidno：6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为seqidno：18、seqidno：19；用于扩增序列为seqidno：7的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为seqidno：20、seqidno：21。上述短体副鳅微卫星位点在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种方面的应用。上述短体副鳅微卫星位点引物对在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种方面的应用。利用上述述短体副鳅微卫星位点引物对检测短体副鳅种群遗传多样性，包括如下步骤：(1)基因组dna的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组dna；(2)微卫星pcr扩增：利用上述短体副鳅微卫星位点引物对，以短体副鳅鳍条组织的基因组dna为模板进行pcr扩增，获得微卫星扩增产物；(3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在abi3730xl测序仪进行毛细管电泳和str分析；(4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用genepop4.0.10计算遗传多样性参数。本发明的有益效果如下：本发明从短体副鳅基因组dna中筛选出了7个微卫星位点，并依据微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物对，采用该特异性引物对扩增短体副鳅基因组dna，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可应用于短体副鳅的种群遗传学、亲缘关系鉴定分析、分子标记辅助育种等领域。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。以下实施例中未注明具体条件的实施方法，通常可按常规条件，如j.萨姆布鲁克(sambrook)等编写的《分子克隆实施指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。实施例1短体副鳅微卫星位点和引物对的筛选一、含有微卫星位点的序列查找：从构建的短体副鳅基因文库的序列中用软件ssrhunter1.3进行微卫星序列的查找；参数设置为查找含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上的序列，共筛选出50个含有微卫星重复的位点；二、微卫星引物设计：从含有微卫星的基因序列中，选取符合引物设计的序列，使用primerpremier5.0进行引物设计；主要参数设置为：引物长度17～25bp，20bp为最适长度，pcr产物片段长度范围100～350bp，最适退火温度55～65℃；gc含量一般在40％～60％之间，尽量避免二级结构出现；三、对设计的引物进行多态性检测：(1)基因组dna的提取：采用酚氯仿法提取32尾短体副鳅鳍条组织的基因组dna；(2)微卫星pcr的扩增：采用设计的微卫星荧光引物，扩增短体副鳅基因组dna；反应体系40μl：模板dna4μl(10ng/μl)，正反向引物各2.0μl(10pmol/μl)，0.4μlex-taq酶(5u/μl)，4μl10×pcrbuffer(mg2+plus)，3.0μldntps(2.5μmol/μl)，用灭菌双蒸水补足至40μl；(3)pcr反应在abi9700pcr仪中进行，扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，各位点退火温度下(各位点退火温度见表2所示)复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最终72℃延伸5min；(4)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在abi3730xl测序仪进行毛细管电泳和str分析以确定短体副鳅微卫星位点在不同个体上的等位基因大小；(4)遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用genepop4.0.10计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的位点。经过多样性检测，本发明共筛选出7个具有遗传多态性的微卫星位点，其核苷酸序列分别为seqidno:1～7，其设计的多态性引物的信息如表1所示。表1短体副鳅微卫星位点及对应引物信息表28个微卫星位点的退火温度、片段长度、多态性等的相关信息位点片段长度(bp)退火温度tanahoheppo-5108-13652130.9830.768ppo-24132-1624870.5250.604ppo-34146-16052160.9180.880ppo-52166-1865080.8030.651ppo-59182-1945080.6390.674ppo-85224-26053110.7050.813ppo-101238-26253110.5900.601实施例2短体副鳅微卫星位点引物对的应用采用实施例1获得的表2中的短体副鳅微卫星位点引物对，对30个短体副鳅鳍条组织的基因组dna进行扩增，检测短体副鳅种群遗传多样性，具体包括如下步骤：(1)基因组dna的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组dna；(2)微卫星pcr扩增：利用表1中的短体副鳅微卫星位点荧光引物对，以短体副鳅鳍条组织的基因组dna为模板进行pcr扩增，获得微卫星扩增产物；(3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在abi3730xl测序仪进行毛细管电泳和str分析；(4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用genepop4.0.10计算遗传多样性参数。遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从7到16不等，平均等位基因数目为10.6个，观测杂合度的范围从0.525到0.983，期望杂合度的范围从0.604到0.880，这证明本发明筛选的微卫星位点和设计的引物具有遗传多态性。用本发明的微卫星引物还可用于短体副鳅的遗传多样性、放流效果评估、亲缘关系分析及分子标记辅助育种等领域研究。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。序列表<110>水利部中国科学院水工程生态研究所<120>短体副鳅微卫星位点及其引物和应用<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>122bp<212>dna<213>短体副鳅（paracobitispotanini）<400>1ggcgtggtctcttttcaaactgtatgtacagtataaactcccacctaccaaaaccctgac60agacagacagacagacagacagacagacagactgtgtgtaaggcttcagatgtctgtgtg120aa122<210>2<211>150bp<212>dna<213>短体副鳅（paracobitispotanini）<400>2cagaatccggggaaaacatataagcctcaactttcacacacactacgcaggaaactttac60atttaacttctttctttctttctttctttctttctttctttctttcttgtaatatgtggt120aatgcaattagctggtcatgtcattggaaa150<210>3<211>141bp<212>dna<213>短体副鳅（paracobitispotanini）<400>3tcccactgccctaaaatgtcatctatctttctatctatctatctatctatctatctatct60atcttttcgtgtaaggaaaaaataacaacgaatatacaaatgaatcatcaagtaaattcg120ccagcgggtatagctttctcg141<210>4<211>176bp<212>dna<213>短体副鳅（paracobitispotanini）<400>4caaaacattttcctggttagggttatattatatccatatttatatccagtacagatattg60tgttgctgttgatttgtttgtttgtttgtttgtttgtaggtttgtacaggaagtctggta120aactggtgtttcttggtttagacaatgctggaaaaacaacacttctgcacatgctg176<210>5<211>194bp<212>dna<213>短体副鳅（paracobitispotanini）<400>5tcattttggaccctgtgtgatggtacagagaagaacagagagacagacagaaagaaagaa60agaaagaaagaaagaaagaaagaaagggacagttaaagacacagagagagagacggccgg120gtaaatgtgtgtcagtgtgagcaggagaagaggcagatgtgaatgaagaaggcgagcagg180agttctgtggcaat194<210>6<211>227bp<212>dna<213>短体副鳅（paracobitispotanini）<400>6tgtggtattgaagcccaatgtttcatctaattcttatctcttatctttgcaacatcgttt60gaatcataatagatagatagatagatagatagatagatagatagatgcagaatgtttgac120tgccataaatgcattttttcccatgacccctttagtctttgattatgatgaaataacctg180ttatcttctgaccccaataactcctgcaagtaccctgtgttgccgtc227<210>7<211>241bp<212>dna<213>短体副鳅（paracobitispotanini）<400>7ctgcatgtgcaggtcaatttcaccctatttctgcctgttatatgcctttaggacaatata60aatgccataatttatgccaaaataattggtacatctttaaataacagcattttttgcaag120gcttgcatttggttaaacatgcatttttttctatttacattttatttatgggacacgcac180gcacgcacgcacgcacgcacacttaatttttatatttttcttccagagaggaagatgcaa240a241<210>8<211>21bp<212>dna<213>人工序列<400>8ttcacacagacatctgaagcc21<210>9<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>9ggcgtggtctcttttcaaac20<210>10<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>10cagaatccggggaaaacata20<210>11<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>11tttccaatgacatgaccagc20<210>12<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>12cgagaaagctatacccgctg20<210>13<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>13tcccactgccctaaaatgtc20<210>14<211>22bp<212>dna<213>人工序列<400>14caaaacattttcctggttaggg22<210>15<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>15cagcatgtgcagaagtgttg20<210>16<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>16attgccacagaactcctgct20<210>17<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>17tcattttggaccctgtgtga20<210>18<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>18tgtggtattgaagcccaatg20<210>19<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>19gacggcaacacagggtactt20<210>20<211>20bp<212>dna<213>人工序列<400>20ctgcatgtgcaggtcaattt20<210>21<211>21bp<212>dna<213>人工序列<400>21tttgcatcttcctctctggaa21当前第1页12