本发明涉及医药技术研究领域，特别涉及前列腺癌干细胞标志物、抗体ov6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用及标记方法。
背景技术
前列腺癌(prostatecancer,pca)是仅次于肺癌的发病率最高的肿瘤之一，特别在发达国家的男性中，前列腺癌已成为发病率最高的肿瘤。据2015年公布的全球数据估计，每年新发前列腺癌患者达111.2万人，30.8万人死于前列腺癌。相对西方国家，亚洲地区前列腺癌的发病率和病死率较低，在中国，前列腺癌的发病率及病死率远低于世界平均水平。然而，研究数据表明，中国的前列腺癌发病率正在逐年攀升，前列腺癌的发病率在近30年间增长了将近6倍，死亡人数则从每年约6000人上升到每年近1.8万人，增长幅度超过了200％，并且新发晚期前列腺癌的比例接近30％，远远高于世界平均水平。另一项2015年的研究调查显示，中国每年前列腺癌新发病例超过6万人，新增死亡病例估计在2.66万人。因此，前列腺癌不仅是世界范围内重要的健康问题，在我国，因其发病率和死亡率增长之迅速，以及晚期前列腺癌的高发比例，前列腺癌亦成为威胁国民健康的重要问题之一。
肿瘤干细胞被认为是癌症复发、转移的主要原因，癌症治疗中以肿瘤干细胞为靶标的重要性已被指出。但是肿瘤组织中肿瘤干细胞比率较低，特异性识别肿瘤干细胞并进行治疗是极其困难的。肿瘤干细胞的检测技术以及以肿瘤干细胞为靶标的新疗法的开发已成为癌症医疗中的重要课题。目前，作为已知的肿瘤干细胞标记，有cd133、cd24、cd44等分子标记，据说仅在极少数癌细胞中具有有效性，为了在更多种类的癌症中检测肿瘤干细胞，需要鉴定新的分子标记。目前前列腺癌干细胞的标志物主要包括cd133、cd44、整合素α2β1等，但是，一方面，他们表征的前列腺癌细胞是否属于前列腺癌干细胞还存在争议，有研究报道，隐藏在cd44+α2β1hi下的cd133-细胞才是肿瘤起始细胞，另一方面，这些标志物在多数前列腺癌细胞系和组织中的表达丰度存在较大差异，这些都大大影响了前列腺癌干细胞研究的深入和临床应用的探索。
技术实现要素：
本发明一方面提供了一种前列腺癌干细胞标志物，标志物为抗体ov6。
本发明另一方面提供了抗体ov6在前列腺癌干细胞标志材料中的应用。
本发明还提供了一种利用ov6作为标志物对前列腺癌干细胞进行标记的方法，包括以下步骤：
a.利用minimacstmcellsorter(miltenyibiotec，bergischgladbach，germany)进行磁激活细胞分选(macs)，具体为用小鼠源性ov6抗体标记前列腺癌细胞系或前列腺癌组织细胞30分钟；
b.将ov6抗体标记的前列腺癌细胞系或前列腺癌组织细胞，与大鼠抗小鼠igg、磁性微珠一起孵育；
c.将孵育后的体系置于macsms柱(miltenyibiotec，bergischgladbach，德国)上进行过滤分离，得到ov6阳性前列腺癌细胞，即为前列腺癌干细胞。
minimacstmcellsorter为细胞分选仪，磁激活细胞分选(macs)为利用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞，在外加磁场的作用下，将样品中与不带磁的细胞分开，达到分离纯化目的的方法。macs为现有技术手段。
具体地，前列腺癌细胞系为c4-2和c4-2b。前列腺癌细胞系c4-2和c4-2b是由lelandchung博士认证(雪松-西奈医学中心，洛杉矶，ca，美国)提供的。c4-2、c4-2b细胞在rpmi1640培养液(11835093，gibco，美国)含10％胎牛血清(fbs，10099-141、gibco、美国)中培养，辅以1％青霉素/链霉素(15140122，gibco，美国)。
优选地，前列腺癌细胞系c4-2、c4-2b细胞在rpmi1640培养液含10％胎牛血清中培养，辅以1％青霉素/链霉素。
进一步地，步骤a中的前列腺癌细胞系在用小鼠源性ov6抗体标记前，采用恩杂鲁胺(enzalutamide，enz，s1250，selleck，usa)对其进行药物刺激。
由于前列腺癌细胞所具有的抗药性，直接用小鼠源性ov6抗体进行标记时，标记效果虽然优于现有的前列腺癌干细胞标志物，但标记效果的显著性仍需要提高，本发明在前列腺癌细胞系与抗体结合前，先用恩杂鲁胺对前列腺癌细胞系进行刺激，处理掉抗药性较低的前列腺癌细胞，保留恶性程度更高的前列腺癌细胞，如此，ov6对前列腺癌细胞的标记效果大大增强。
恩杂鲁胺为前列腺癌内分泌治疗失败的二线用药，是目前治疗晚期激素抵抗性前列腺癌的重要药物。但是绝大多数患者接受恩杂鲁胺一段时间后都会表现出药物抵抗，进而出现疾病进展，在本申请中，采用恩杂鲁胺预先处理掉抗药性低的前列腺癌细胞，进而能够筛选出高恶性的前列腺癌细胞。
在一个具体实施例中，分别将5×106个前列腺癌细胞系，例如c4-2和c4-2b细胞铺板于10cm皿中，24小时后加入恩杂鲁胺，刺激48小时。恩杂鲁胺(enzalutamide，enz，s1250，selleck，usa)。铺板5×106个细胞，24小时贴壁细胞密度为60-70％，加入恩杂鲁胺刺激48小时，恩杂鲁胺药物通过阻断雄激素受体发挥药物作用，刺激48小时，敏感细胞会出现显著凋亡。
为了检验ov6对前列腺癌干细胞的标记效率，步骤c后还包括采用流式细胞术检测ov6阳性前列腺癌细胞标记效率的步骤，具体如下：
d.对于上述步骤中ov6阳性前列腺癌细胞进行ov6表达比例检测，利用apc偶联的ov6抗体(1:50，fab2020a，r&dsystems，minneapolis，mn，usa)标记ov6阳性前列腺癌细胞；
e.利用cyanadp分选仪(beckman，ca，usa)进行流式细胞术测定apc-ov6(apc偶联的ov6抗体)细胞的比例分布，即得到ov6阳性前列腺癌细胞的标记效率。
流式细胞术(flowcytometry，fcm)是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
本发明的有益效果是：
(1)本发明能够对前列腺癌干细胞进行显著标记，ov6基础表达丰度稳定在2-8％之间，并且ov6阳性细胞具有干性相关表型，即高表达干性相关基因，高成球率和高成瘤率。
(2)本发明前列腺癌细胞系在用小鼠源性ov6抗体标记前，先采用恩杂鲁胺进行药物刺激，保留高恶性前列腺癌细胞，增强了ov6对前列腺癌细胞的标记效果。
(3)本发明的标记方法具有较高的特异性和敏感性，具有重要的临床价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：通过磁激活细胞分选(macs)标记ov6阳性前列腺癌细胞的过程；
图2：通过流式细胞术计算的apc-ov6的百分比；
图3：正常前列腺和前列腺癌组织中，代表性苏木精伊红(h&e)染色和ov6的免疫组织化学(ihc)染色；
图4：正常前列腺和前列腺癌组织中ov6的ihc评分；
图5：前列腺癌患者的同种样品不同格里森评分的区域的代表性h&e染色和ov6的ihc染色；
图6：前列腺癌患者的同种样品不同格里森评分的区域中分布的ov6表达百分比；
图7：前列腺癌患者的生化复发(bcr)和无病生存(dfs)的kaplan-meier曲线；
图8：实时定量pcr分析ov6-和ov6+c4-2b细胞中干性相关基因(cd133，cd44，sox2，oct4，myc，klf4)表达水平；
图9：连续传代的ov6+和ov6-细胞衍生球体的代表性图像及数量比较(比例尺＝100μm)；
图10：一代和二代移植后ov6-或ov6+c4-2b细胞的小鼠皮下肿瘤的生物发光成像及计算致瘤细胞频率估计和p值。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
细胞系来源：前列腺癌细胞系c4-2和c4-2b是由lelandchung博士认证(雪松-西奈医学中心，洛杉矶，ca，美国)提供的。c4-2、c4-2b细胞在rpmi1640培养液(11835093，gibco，美国)含10％胎牛血清(fbs，10099-141、gibco、美国)中培养，辅以1％青霉素/链霉素(15140122，gibco，美国)。
恩杂鲁胺(enzalutamide，enz，s1250，selleck，usa)
①分别将5×106个c4-2和c4-2b细胞铺板于10cm皿(430167，coring，usa)中，24h后加入恩杂鲁胺(5nm)，刺激48小时。
②利用minimacstmcellsorter(miltenyibiotec，bergischgladbach，germany)进行磁激活细胞分选(macs)，具体为用小鼠源性ov6抗体(1:50，mab2020，r&dsystems，minneapolis，mn，usa)标记enz处理的c4-2及c4-2b细胞30分钟；
③将ov6一抗标记的c4-2及c4-2b细胞，与大鼠抗小鼠igg、磁性微珠一起孵育；
④将将孵育后的体系置于macsms柱(miltenyibiotec，bergischgladbach，德国)上进行过滤分离，得到ov6阳性前列腺癌细胞，即为前列腺癌干细胞。macsms柱分选ov6阳性细胞的过程如图1所示，经过一抗ov6、二抗磁珠标记后，磁力架过柱得到ov6阳性前列腺癌细胞。
⑤对ov6阳性前列腺癌细胞进行ov6表达比例检测，利用apc偶联的ov6抗体(1:50，fab2020a，r&dsystems，minneapolis，mn，usa)标记ov6阳性前列腺癌细胞后，利用cyanadp分选仪(beckman，ca，usa)进行流式细胞术进行测定apc-ov6细胞的比例分布，测定结果如图2所示。从图2中可以看出，c4-2及c4-2b细胞的ov6基础表达(未经磁激活细胞分选)比例在6％左右，经过磁激活分选后ov6阳性前列腺癌细胞所占比例85％以上，效率较高。
实施例2
ov6阳性前列腺癌细胞鉴定方法
1、组织样本收集和免疫组化
在2012年和2013年间，收集了队列1：78例在长海医院(中国上海)病理确诊为前列腺癌的患者和队列2：67例在长征医院(中国上海)病理确诊为前列腺癌的患者相关材料，包括临床资料，组织标本和随访资料。
前列腺癌患者的临床资料包括诊断年龄，术前psa(术前6个月内最大值)，术后病理状态包括格里森评分(gs)，病理t分期，病理n分期，包膜外浸润(cp)手术切缘(sm)，周围神经浸润(pni)和精囊侵犯(svi)。生化复发时间(bcr)(标准：psa≥0.2μg/μl)，mri，ct或ect确定疾病复发情况，临床观察终点包括生化无复发生存期和无病生存期。
苏木精-伊红(he)染色的前列腺癌标本重新由两位有经验的病理学家评估(g.j.h.和y.y.w.)进行双盲法验证。根据美国癌症联合委员会(ajcc)2002和世界卫生组织(who)的分类原则评估肿瘤分期和格里森评分。临床样本获取过程是根据第二军医大学伦理委员会批准的既定方案，在患者签订书面知情同意书。
将石蜡包埋的前列腺癌样品切片在二甲苯中脱蜡，重新水合，在抗原修复后，在3％h2o2的甲醇溶液中在室温下孵育30分钟以灭活内源性过氧化物酶。将切片在室温下用5％bsa封闭20分钟，然后用小鼠抗ov6(1:100，mab2020，r&dsystems，usa)于4℃过夜。然后用过氧化物酶嵌合的抗生蛋白链菌素孵育，并使用二氨基联苯胺(dab-2031，mxbbiotechnologies，china)显影。蛋白质表达评分(ihc评分)通过染色强度和免疫反应评分后阳性染色细胞的百分比(irs评分)进行综合评判。免疫组化分析由两名独立的研究者进行。
结果：1)ov6表达在前列腺癌组织中的表达与前列腺癌的高恶性程度相关；
从图3中可以看出，在正常前列腺和前列腺癌组织中，代表性苏木精伊红(h&e)染色和ov6的免疫组织化学(ihc)染色，按照局限性前列腺癌，局部进展期前列腺癌，去势抵抗性前列腺癌和神经内分泌前列腺癌(比例尺＝50μm)排列，各组ov6的ihc评分见图4。由图4评分可以看出，ov6表达在前列腺癌组织中的表达与前列腺癌的高恶性程度相关。
2)ov6表达在前列腺癌组织中的表达与前列腺癌的低分化程度相关
如图5所示，来自同一例前列腺癌患者样品的具有不同格里森评分(gs)区域的代表性h&e染色和ov6的ihc染色。不同gs的区域中分布的ov6表达百分比(比例尺＝50μm)见图6。
3)ov6表达在前列腺癌组织中的表达与前列腺癌的不良预后相关
如图7所示，根据ov6表达，分析前列腺癌患者的生化复发(bcr)和无病生存(dfs)的kaplan-meier曲线。(队列1，n＝78；队列2，n＝67)。
实施例3
ov6阳性前列腺癌细胞系干细胞特性检测
1.实时聚合酶链式反应检测干性相关基因表达水平
根据制造商的方案，使用rnaisoplus(9109，takara，日本)，抽提c4-2b，c4-2，分选的单核细胞或thp-1的总rna。使用primescriptonesteprt试剂盒(rr037b，takara，japan)在随机引物和逆转录酶存在下进行逆转录。所产生的cdna的扩增在sybrgreenrealtimepcrmastermix(qpk201，toyobo，japan)和abiprism7300htsequencedetectionsystem中进行。
每个测量一式三份进行，结果通过β-actin基因的表达来标准化。倍数相对于平均值的变化由2-△△ct确定，结果如图8所示，数据表示为相对于ov6-c4-2b细胞的倍数变化，表明ov6阳性前列腺癌细胞具有高表达干性相关基因。
2.成球实验检测ov6阳性前列腺癌细胞体外成球能力
成球能力测定，将5000个经过磁激活细胞分选的细胞的单细胞悬浮液在6孔超低附着培养板(corning，usa)中孵育5天。在显微镜下计数形成的球状体的数量，并拍摄代表性图片，如图9所示，ov6阳性前列腺癌细胞具有更高成球能力。
3.体内有限稀释成瘤实验检测ov6阳性前列腺癌细胞体内成瘤能力
所有的实验动物程序均经中国上海第二军医大学动物护理与使用委员会批准。从上海实验动物中心(slac，china)购买nod-scid小鼠(雄性，7周龄)并且在特定的无病原体条件下饲养。
体内有限稀释测定，将分选的ov6+和ov6-前列腺癌细胞连续稀释至5000、10000、20000个细胞/50μl的细胞密度。注射细胞并对不同注射细胞量形成的肿瘤数量进行评分。使用由霍尔研究所walter和eliza提供的elda软件(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html)计算肿瘤干细胞的频率。图10显示了一代和二代移植后ov6-或ov6+c4-2b细胞的小鼠皮下肿瘤的生物发光成像，并且通过有限稀释分析工具计算致瘤细胞频率估计和p值(http//bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)。从图10的数据可以看出，ov6阳性前列腺癌细胞具有更高成瘤能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。