本发明涉及免疫学领域。具体地，本发明主要涉及可特异性识别和结合蛋白stathmin的单克隆抗体(例如本文所述的c3和c16单克隆抗体)，产生所述单克隆抗体的杂交瘤，包含所述单克隆抗体的组合物，以及所述单克隆抗体的使用方法和用途。
发明背景
食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，escc)是我国多发的消化道恶性肿瘤，其早期症状不明显，诊断时多为中晚期，因此预后不良。目前，已发现和可用于食管癌的血清标志物敏感性偏低，文献报道中灵敏度最高的cyfra21-1也仅有45.5％，单独应用于食管癌的诊断价值不大。因此，临床上仍然缺乏食管鳞癌特异的诊断标志物。
本发明人的前期工作应用蛋白质组学技术筛选用于诊断和监测的食管鳞癌特异标志物。经二维电泳(2de)分离-基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，maldi-tof-ms)分析了8对伴随淋巴结转移和无淋巴结转移escc组织的差异蛋白表达谱，提示stathmin是一种在食管鳞癌中高表达的蛋白。stathmin(stmn1)是近年来研究较多的一个微管解聚蛋白，通过磷酸化调节自身活性从而影响细胞内微管系统动力平衡，对细胞周期的变化起着重要作用。研究发现在多种人类恶性肿瘤中stathmin过表达，故亦称为癌蛋白18(op18)。实验室前人通过elisa检测食管鳞癌患者以及正常人血清stathmin水平，提示食管鳞癌患者血清中stathmin浓度升高并与食管癌淋巴结转移相关。利用血清stathmin浓度对食管鳞癌诊断的灵敏度达到93.3％特异性达到86.7％，均显著优于目前已有的食管癌肿瘤标志物，提示stathmin可作为食管鳞癌诊断、治疗和判断预后的一个新的血清标志物，辅助临床诊断。
然而，市售的stathmin抗体检测效果不佳，价格昂贵，工作浓度偏高。因此，仍然存在对效果更好、使用成本更低的优质stathmin抗体的需要。
技术实现要素：
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“stathmin(stmn-1)”是本领域内熟知的，其是由人stmn1基因编码的微管解聚蛋白。在本申请中，“stathmin”、“stathmin-1”和“stmn-1”可互换使用。stathmin通过磷酸化调节自身活性从而影响细胞内微管系统动力平衡，对细胞周期的变化起着重要作用。stathmin在多种人类恶性肿瘤包括食管鳞癌中过表达，故其亦被称为癌蛋白18(op18)。stathmin蛋白的示例性编码核苷酸序列如seqidno：1所示。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196：901-917；chothia等人(1989)nature342：878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，stathmin)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，fundamentalimmunology，ch.7(paul，w.，ed.，第2版，ravenpress，n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括fab、fab′、f(ab′)2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“fd片段”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“fv片段”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward等人，nature341：544-546(1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语f(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scfv)，其中vl和vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，bird等人，science242：423-426(1988)和huston等人，proc.natl.acad.sci.usa85：5879-5883(1988))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448)。可用于本发明的其它接头包括由alfthan等人(1995)，proteineng.8：725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31：94-106，hu等人(1996)，cancerres.56：3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293：41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述的那些。
在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，holligerp.等人，proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448(1993)，和poljakr.j.等人，structure2：1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如c3和c16单克隆抗体)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
如本文中所使用的，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，c3和c16单克隆抗体是与从c3和c16杂交瘤细胞株或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。
可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如，stathmin)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请wo03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本发明的单克隆抗体(例如，c3和c16单克隆抗体)竞争结合stathmin蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合部分。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗原的结合。通常，抗体以小于大约10-7m，例如小于大约10-8m、10-9m或10-10m或更小的亲和力(kd)结合抗原。
如本文中所使用的，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的c3和c16单克隆抗体)以小于大约10-7m，例如小于大约10-8m、10-9m或10-10m或更小的解离平衡常数(kd)结合抗原(例如，stathmin蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株c3和c16时，其还指杂交瘤细胞株c3和c16的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的，术语“患者”是指哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见immunology-asynthesis(第2版，e.s.golub和d.r.gren，eds.，sinauerassociates，sunderland，mass.(1991))，其通过引用合并入本文。
因此，在一个方面，本发明提供了特异性结合stathmin的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)或其抗原结合部分，所述单克隆抗体可由保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，具有保藏号cctccno：c2016185(例如，产生c3单克隆抗体)或cctccno：c201713(例如，产生c16单克隆抗体)的杂交瘤产生。
在另一个方面，本发明提供了特异性结合stathmin的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区。
在一个实施方案中，所述重链可变区包含seqidno：13或seqidno：19所示的cdr1、seqidno：14或seqidno：20所示的cdr2和seqidno：15或seqidno：21所示的cdr3，以及所述轻链可变区包含seqidno：16或seqidno：22所示的cdr1、seqidno：17或seqidno：23所示的cdr2和seqidno：18或seqidno：24所示的cdr3。
在一个实施方案中，所述重链可变区包含seqidno：13所示的cdr1、seqidno：14所示的cdr2和seqidno：15所示的cdr3，以及所述轻链可变区包含seqidno：16所示的cdr1、seqidno：17所示的cdr2和seqidno：18所示的cdr3。在另一个实施方案中，所述重链可变区包含seqidno：19所示的cdr1、seqidno：20所示的cdr2和seqidno：21所示的cdr3，以及所述轻链可变区包含seqidno：22所示的cdr1、seqidno：23所示的cdr2和seqidno：24所示的cdr3。
具有与seqidno：13-24所示序列无实质不同(例如具有保守氨基酸替代)的cdr序列的抗体包括在本发明的范围内。通常，这包括用一个具有相似电荷、疏水性或立体化学特征的氨基酸来替代一个氨基酸。与cdr区域相反，只要替代不会不利地影响所述抗体的结合特性，在fr区域也可以发生更强烈的替代。替代也可用来对所述抗体进行种系转化或稳定抗原结合位点。
保守氨基酸替代将产生具有与从中进行这类修饰的分子相似的功能和化学特征的分子。例如，保守氨基酸替代可能涉及用非天然的残基替代天然的氨基酸残基，这样对在该位点的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。这样的保守氨基酸替代在本领域中是已知的。
所想要的氨基酸替代(无论是保守还是非保守的)可由本领域技术人员在想要进行这类替代的时候确定。在某些实施方案中，保守氨基酸替代也包括非天然发生的氨基酸残基，所述氨基酸残基通常通过化学的肽合成而不是通过生物系统中的合成而被整合的。
在另一个方面，本发明提供了特异性结合stathmin的抗体或其抗原结合部分，其与上述的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)竞争结合stathmin上的相同表位。
在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤，其以保藏号cctccno：c2016185和cctccno：c201713保藏在cctcc。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
在另一个方面，本发明提供了检测stathmin在样品中的存在或其表达水平的方法，其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述样品是组织样品，例如癌组织(例如食管鳞癌组织、结直肠癌组织、结肠癌、移行细胞癌组织等)样品。在一个实施方案中，所述样品是细胞样品，例如细胞裂解液。在一个实施方案中，所述样品是血液样品，例如血清样品、血浆样品。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个实施方案中，所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的，例如但不限于可识别本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)的抗小鼠igg抗体。在一个实施方案中，所述方法包括但不限于，western印迹法、elisa法、alphalisa法和免疫组织化学法。在一个实施方案中，所述方法不是疾病的诊断方法。
在另一个方面，还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合部分的用途，其用于检测stathmin在样品中的存在或其表达水平，或者用于制备试剂盒，所述试剂盒用于检测stathmin在样品中的存在或其表达水平。
在一个实施方案中，所述样品包括但不限于，组织样品，例如癌组织(例如例如食管鳞癌组织、结直肠癌组织、结肠癌组织、移行细胞癌组织等)样品，血液样品，例如血清样品、血浆样品，以及细胞样品，例如细胞裂解液。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个实施方案中，所述试剂盒可以是但不限于，elisa试剂盒、alphalisa试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，所述第二抗体可以是例如但不限于可特异性识别本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)的抗小鼠igg抗体。在一个实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。
之前已报道，stathmin可用作标志物，用于对患有癌症(例如食管鳞癌、结直肠癌、结肠癌、移行细胞癌等)的患者进行早期诊断、转移和复发的监测以及预后判断(h.q.zhang等人，stmn1incoloncancer:expressionandprognosisinchinesepatients，europeanreviewformedicalandpharmacologicalsciences2016；20:2038-2044；divyabhagirath等人，expressionofcd147，bigh3andstathminandtheirpotentialroleasdiagnosticmarkerinpatientswithurothelialcarcinomaofthebladder，clinicachimicaacta413(2012)1641–1646；hweetongtan等人，proteomicanalysisofcolorectalcancermetastasis:stathmin-1revealedasaplayerincancercellmig比率nandprognosticmarker，j.proteomeres.2012，11，1433-1445；赵楠等人，食管鳞癌患者血清stathmin的表达及临床意义，《世界华人消化杂志》，2014年5月18日；22(14):2016-2022)。
因此，在另一个方面，本发明提供了对患有癌症的患者进行早期诊断、转移或复发的监测以及预后判断的方法，其包括使用根据本发明的抗体或其抗原结合部分检测来自所述患者的样品中stathmin的表达水平。
在一个实施方案中，所述癌症包括但不限于食管鳞癌、结直肠癌、结肠癌、移行细胞癌。在一个实施方案中，所述样品包括但不限于，组织样品，例如癌组织(例如例如食管鳞癌组织、结直肠癌组织、结肠癌组织、移行细胞癌组织等)样品，血液样品，例如血清样品、血浆样品，以及细胞样品，例如细胞裂解液。在一个实施方案中，所述抗体是本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)。在一个实施方案中，与对照相比，所述样品中更高水平的stathmin预示着，所述患者患有癌症、癌症发生转移或复发或者预后结果更佳。此类对照可以由本领域技术人员容易地确定。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个实施方案中，所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测根据本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的，例如但不限于可识别本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)的抗小鼠igg抗体。
在另一个方面，还提供了根据本发明的抗体或其抗原结合部分在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于对患有癌症的患者进行早期诊断、转移或复发的监测或者预后判断。
在一个实施方案中，所述癌症包括但不限于食管鳞癌、结直肠癌、结肠癌、移行细胞癌。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个实施方案中，所述试剂盒可以是但不限于，elisa试剂盒、alphalisa试剂盒。在一个实施方案中，所述抗体是本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)的抗小鼠igg抗体。在进一步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包含可检测的标记。在一个实施方案中，所述试剂盒可以是但不限于，elisa试剂盒、alphalisa试剂盒。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别本发明的单克隆抗体(例如，实施例中所述的c3和c16单克隆抗体)的抗小鼠igg抗体。在进一步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。
在其它优选的实施方案中，本发明的试剂盒可用于检测stathmin蛋白在样品中的存在或其表达水平，用于对患有癌症的患者进行早期诊断、转移或复发的监测或者预后判断。
附图描述
图1：基于i-tasser预测算法，根据高度同源蛋白stmn4-微管蛋白复合体晶体结构计算预测的stathmin(人)蛋白的晶体结构丝带图。绿色-表示蛋白结构表面的环区；黄色-表示蛋白结构中的beta折叠区域；红色-表示蛋白质结构中的α螺旋区域。由于末端11个氨基酸(139-149)的同源性较差，结构预测并不准确。鉴于其氨基酸亲水性很高，序列中以环区标注。
图2：stathmin与人类同家族蛋白stmn-2、stmn-3、stmn-4的同源性比对。同源性标注于序列下方，“*”代表序列相同；“:”代表同源性较高；“.”代表同源性较低；无标记则无同源性。
图3：kyse170-stmn细胞裂解物的western印迹分析结果。图3a示出以本发明的单克隆抗体(第2、4泳道)、单抗对照(第6泳道)和多抗对照(第8泳道)作为一抗显影的western扫描图；第1、3、5、7泳道均使用蛋白质标准品上样。图3b示出同一张膜上以抗肌动蛋白抗体作为一抗显影的western凝胶图。
图4：c3和c16单克隆抗体的抗原(skdpadetead，seqidno：5，图4a)以及山羊多抗nb100-2560的抗原(knkeskdpadetead，seqidno：12，图4b)上的表位的软件分析。
图5：使用本申请的c3和c16单克隆抗体以及对照抗体的alphalisa检测的技术流程概述。
图6：stathmin生物素标记实验结果。左图为dab染色，中图、右图为western印迹检测。
图7：标记蛋白与链霉亲和素供体微球结合实验结果。western印迹检测stathmin与dab染色条带共定位，说明生物素标记stathmin可与供体微球结合。
图8：使用本申请的c3(图8a)和c16(图8c)单克隆抗体以及对照抗体(图8b：c4抗体；图8d：ab67337小鼠单抗)的alphalisa检测的标准曲线。图8a：y＝-2152in(x)+17845，r2＝0.980；图8b：y＝-1129in(x)+16924，r2＝0.981；图8c：y＝-498in(x)+9910，r2＝0.969；图8d：y＝-2278in(x)+14848，r2＝0.972。
图9：对来自食管鳞癌受试者和健康受试者的临床血清样品使用本申请的c3(图9a)和c16(图9c)单克隆抗体以及对照抗体(图9b：c4抗体；图9d：ab67337小鼠单抗)的alphalisa检测的结果。
图10a：对来自食管鳞癌受试者的临床样品使用本申请的c3和c16单克隆抗体以及对照抗体的alphalisa检测的结果的比较。图10b：对来自健康受试者的临床样品使用本申请的c3和c16单克隆抗体以及对照抗体的alphalisa检测的结果的比较。
保藏信息
产生本申请的特异性结合stathmin的单克隆抗体的两株杂交瘤分别于2016年11月9日以保藏号cctccno：c2016185保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)和于2017年1月11日以保藏号cctccno：c201713保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如，分子生物学实验方法和免疫检测法)。参见，例如，sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1989)；ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociates(1992)；和harlow和lane，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1990)，其全部通过引用合并入本文。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如在本领域内通常使用的或如本文描述的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其它参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1：单克隆抗体的制备
1.抗原多肽设计
靶标蛋白信息
靶标蛋白信息如表2所示
表2.靶标蛋白信息
抗原多肽设计原则
1)晶体结构分析：剔除α螺旋结构区，选取亲水性高的表面非结构区域(本例中β折叠区很小，也包含在了选择范围内)。
2)特异性高：挑选特异序列(至少6个氨基酸)。小于10个氨基酸的加接头补至10-14个氨基酸。
3)从特异的环区和β折叠区序列中挑选多肽，多肽之间重合序列在0-5个氨基酸之间。
stathmin(人)蛋白的晶体结构以及stathmin与人类同家族蛋白stmn-2、stmn-3、stmn-4的同源性比对参见图1和图2。
设计的抗原多肽
stathmin抗原多肽设计见表3，抗原多肽序列中不包含接头。
表3.stathmin抗原多肽序列
2.stathmin抗原多肽合成及偶联
将设计的多肽送交多肽合成公司(强耀生物科技有限公司)合成。
将合成的多肽(包含n端增加的一个胱氨酸)偶联到蛋白载体(例如klh、ova、bsa等)上。每个蛋白载体的表面偶联多个拷贝的多肽序列。偶联多肽的蛋白载体复合物用于免疫小鼠。
3.小鼠免疫
每条多肽免疫3只小鼠(健康雌性balb/c小鼠，8-12周龄)(上海斯莱克实验动物有限责任公司)。免疫剂量一般为50ug-200ug的抗原，两周免疫一次，采用弗氏佐剂与免疫原混合后，皮下注射。总共免疫5次。
最后一次注射后，饲养小鼠并通过elisa(针对bsa缀合的肽)测试抗血清对抗原多肽的反应性。选择抗血清滴度>10k的小鼠用于融合。
4.细胞融合
采用的骨髓瘤细胞为处于对数生长期的balb/c来源的sp2/0细胞(来源于atcc)。取经免疫的小鼠的脾脏，制备脾淋巴细胞的单细胞悬液。然后将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃预热的50％peg4000(ph8.0)1ml，加入30mldmem培养基(美国thermofisherscientific公司)，离心弃上清后加入hat培养基(gibco公司)，悬浮混匀，分装至3.5cm培养皿中，放于湿盒中，并置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。
5.筛选和克隆
融合7-10天后，挑选细胞克隆，使用合成的抗原多肽进行elisa测试，以确定细胞克隆是否产生抗体。对elisa检测呈阳性的细胞进行有限稀释，并在每次有限稀释后5-6天进行elisa测试，测定od280读数。挑取od280读数较高的阳性细胞克隆进行进一步的有限稀释，直至用elisa测定96孔板时，整个96孔板的结果均为阳性。从中挑取od280读数较高的阳性细胞克隆，从而获得产生抗stathmin单克隆抗体的两株杂交瘤细胞株，将其命名为stmn1-c3和stmn1-c16。
6.单克隆抗体的制备和纯化
给10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷。一周后，用1ml注射器给每只小鼠腹腔注射用pbs洗涤和重悬的杂交瘤细胞株的细胞悬液，细胞用量为5×106/只，注射2只小鼠/杂交瘤细胞株。待小鼠腹水积聚后，收集腹水，离心收集上清，并用亲和层析法进行腹水单抗的纯化。单克隆抗体采用proteing(sigma公司生产)进行纯化。
用点杂交进行抗体质控，共得到来自一个抗原表位的2株质控优良的单克隆抗体，具体信息见下表4。测定单克隆抗体的浓度后，将抗体进行分装，并冻存在-20℃。
表4：2株质控优良的单克隆抗体
点杂交的方法：双蒸水溶解抗原多肽，用10μl点样枪将溶解的抗原多肽点在nc膜(1cm×5cm)上，点样体积为2μl，同时点bsa作为对照.37℃干燥后，用含5％bsa的tbst(20mmtris-hcl，150mmol/lnacl，0.05％tween20，ph7.5)室温封闭1h，然后分别将nc膜与抗体(1∶1000稀释)孵育30min，用tbst溶液漂洗3次(3×5min)，用辣根过氧化酶(hrp)标记的羊抗鼠二抗孵育30min，用tbst溶液漂洗3次(3×5min)，再用tbs洗1次(5min)，加入ecl显色试剂，暗室x光片检测。
实施例2：c3和c16单克隆抗体的序列鉴定
以杂交瘤细胞总rna为模板，获得反转录cdna，并利用合适的引物扩增c3和c16单克隆抗体的可变区序列将测序结果采用ncbi网站igblast功能比对，获得可变区类型及cdr序列。本领域技术人员知晓如何设计合适的引物以及进行上述测序实验。经测序结果比对后，显示c3单克隆抗体的重链可变区cdr1-3和轻链可变区cdr1-3的序列分别为序列seqidno：13-18，c16单克隆抗体的重链可变区cdr1-3和轻链可变区cdr1-3的序列分别为序列seqidno：19-24。
实施例3：c3和c16单克隆抗体的效力
在本实施例中，我们采用了本领域技术人员熟知的western印迹检测和elisa方法来测定上述实施例1中获得的c3和c16单克隆抗体的效力。此外，还同时检测了可商购获得的针对stathmin的兔单抗ab52630(abcam)和山羊多抗nb100-2560(novusbiologicals)作为阳性对照。
western印迹检测
实验材料：小鼠单克隆抗体c3和c16，兔单抗ab52630，山羊多抗nb100-2560，针对小鼠、兔或山羊抗体的二抗均购自美国jacksonimmunoresearch公司，肌动蛋白抗体(购自美国ameribiopharma公司，货号ab1015t)，扫膜仪(geimagequantlas4000/4010超灵敏化学发光成像分析仪，或ai600产品超灵敏多功能成像仪)，pageruler蛋白质marker(购自美国thermofisherscientific公司，货号26616)，kyse170-stmn细胞裂解物(食管鳞癌细胞系kyse170为日本京都大学shimaday博士惠赠，kyse170-stmn为本实验室根据常规方法构建的过表达stathmin的细胞系)；其中小鼠单抗1:1000稀释，兔单抗按照说明书1:1000稀释，山羊多抗按照说明书(1:200-1000)选择1:1000稀释。
实验过程：实验室常规western检测流程。
实验结果：western印迹分析的结果示于图3中。结果显示，c3和c16单抗与山羊多抗均无非特异条带，对stathmin有良好的结合特异性，兔单抗ab52630在130kda与72kda有弱的非特异条带；并且c3和c16单抗检测的stathmin条带明显强于兔单抗和山羊多抗，显示其优异的检测灵敏度。肌动蛋白条带整齐，说明上样量较为一致。
亲和力检测
实验材料：小鼠单克隆抗体c3和c16，兔单抗ab52630，山羊多抗nb100-2560，重组stathmin蛋白(将编码seqidno：1所示的氨基酸序列的stmn1基因克隆至pet30a原核表达载体(购自美国thermofisherscientific公司)，经大肠杆菌诱导表达后，采用gehistraphp亲和柱纯化(购自美国gehealthcarelifesciences公司，货号17-5247-01)后获得)。
实验技术：elisa
实验方案：第一组实验采用100ng/ml重组抗原包被，分别梯度稀释上述实验用stathmin抗体作为一抗，检测抗体效价。第二组实验统一采用1:4000稀释抗体，梯度稀释抗原检测抗体检测灵敏度。
快速elisa检测实验步骤：
1)将硝酸纤维素膜ba85(购自美国whatman公司，10401196)切为3mm×3mm的小块，用镊子置于普通96孔板底部。
2)在对应的孔中加入5μl抗原溶液，盖上盖，37℃孵育10min至吸收。
3)用300μltbst洗液(20mmtris-hcl，0.5％吐温20，ph＝7.5)冲洗多余液体，吸出液体，继续用300μltbst洗涤液清洗两次。
4)每个孔中加300μl2％bsa封闭液(购自美国sigma-aldrich公司，albuminbovineⅴ，货号9048-46-8)，37℃孵育1h。
5)吸空液体，用300μltbst洗涤液清洗三次，彻底吸干。
6)每个孔中加100μl一抗，37℃孵育1h(或室温孵育3h)。
7)吸空残留液体，每个孔中加满洗涤液，吸空残留液体，重复3次。
8)每个孔中加100μl二抗，室温孵育1h。
9)吸干残留液体，每个孔中加满洗涤液，吸空残留液体，重复3～5次。
10)最后一次用洗涤液浸泡5min，彻底吸干残留液体。
11)加底物液显色：于各反应孔中加入tmb显色液(surebluetmb1-csubstrate，购自美国kirkegaard&perrylabs(kpl)，货号52-00-01)50μl，室温显色10～15分钟。
13)终止反应：于各反应孔中加入终止液(购自美国kirkegaard&perrylabs(kpl)，货号50-85-30)50μl。
14)结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，在分光光度计上，于450nm以空白对照孔调零后测各孔od值，若大于规定的阴性对照od值的2.1倍，即判断为阳性(+)。此判定方法还被称为s/n或p/n法，可参见例如tijssenp.，practiceandtheoryofenzymeimmunoassays.amsterdam:elsevier，1985。
实验结果如下：
表5.抗体梯度稀释的抗体效价检测实验结果(od450值)
表6.抗原梯度稀释的抗体灵敏度检测实验结果(od450值)
表7.抗体梯度稀释的抗体效价检测实验结果(+显示测定的od值大于规定阴性对照od值的2.1倍)
表8.抗原梯度稀释的抗体灵敏度检测实验结果(+显示测定的od值大于规定阴性对照od值的2.1倍)
实验结论：c3和c16抗体的效价和检测灵敏度均显著高于空白对照，表明对stathmin有良好的结合性质。结果还显示，c3和c16单抗的效价和检测灵敏度均优于商用抗体，且商用单抗工作性能优于商用多抗。
所用抗体的抗原表位分析
采用bepitope软件(odoricom，pellequerjl.bepitope:predictingthelocationofcontinuousepitopesandpatternsinproteins.jmolrecognit，2003，16(1):20-22)分析了c3和c16单抗的抗原skdpadetead和商品化山羊多抗nb100-2560的免疫原knkeskdpadetead，结果见图4a和4b；兔单抗ab52630的免疫原未知，故未进行分析。
图4a显示，c3和c16单抗的抗原上的预测表位仅有一个。表位单一，抗体的识别位点相对应该更为准确。
图4b显示，山羊多抗nb100-2560的抗原上的预测表位有三个。表位复杂，则抗体的识别特异性和灵敏度会较差。此外，多抗的可重复性比较差，即使是用相同的免疫原制备多抗，不同批次间也会存在明显差异，因此在特异性、实验的稳定性和一致性方面由较大的局限性。
抗原表位的这些分析结果与上述检测抗体效力的实验结果一致。
实施例4：单克隆抗体c3和c16在alphalisa中的应用
alphalisa技术原理
alphalisa是近年来兴起的一项新技术，其主要利用分子间相互作用原理，以硅胶微球为载体。该技术采用表面化学处理硅胶微球，供体微球和受体微球表面包被有亲和涂层可以结合待测生物分子，分子间相互作用会将供体和受体微球拉近至单线态氧扩散范围以内，即200nm以内，从而激发级联放大的化学发光反应。其发光原理为光激化学发光，供体微球表面涂布光敏剂苯二甲蓝，受体微球表面涂布发光剂二甲噻吩衍生物并螯合有稀土原子铕。因而，当用680nm的激光照射时，供体微球表面光敏剂分解环境中的氧，形成单体氧分子(氧自由基)，单体氧分子扩散到受体微球，将能量最终传递给稀土原子铕，激发波长为615nm半衰期为0.3s的激发光，可以采用荧光扫描仪检测。
仪器与材料
仪器：perkinelmerenspire多功能酶标仪
材料：重组stathmin蛋白，thermo活化生物素试剂盒，小鼠抗stathmin单克隆抗体c3、c4和c16，小鼠单抗ab67337，perkinelmeralphalisa蛋白a受体微球，perkinelmeralphalisa链霉亲和素供体微球，perkinelmeralphalisa通用缓冲液，乳白色384孔板。
alphalisa技术流程
参见图5。具体检测步骤如下：
1)在乳白色384孔板中，每个孔加入5ng/ml标记抗原溶液10μl
2)加入10μl检测标准品或血清
3)加入10μl抗体溶液
4)加入10μlalphalisa受体微球工作液(20μg/ml)
5)覆盖覆膜，37℃孵育1h
6)加入供体微球工作液(20μg/ml)10μl
7)覆盖覆膜，37℃孵育1h
8)停止孵育，揭开覆膜，采用perkinelmerenspire多功能酶标仪扫描检测。
实验结果
1)重组蛋白表达标记
制备的重组stathmin蛋白被生物素标记以在alphalisa实验中可以与alphalisa链霉亲和素标记供体微球结合(参见图7)。将蛋白进行电泳检测，结合于蛋白质上的生物素可经dab染色显现黄色，若黄色条带与stathmin蛋白条带共定位，则说明蛋白已被生物素化(参见图6)。
2)各单克隆抗体的alphalisa检测标准曲线
根据上文所述的alphalisa检测流程利用不同量的竞争抗原标准品获得各单克隆抗体的alphalisa检测荧光信号，并据此绘制标准曲线。结果见下表9，相应的标准曲线见图8a-d。
表9：
上表的数据以及图8a-d显示，c3、c16抗体标准曲线具有最高荧光信号比率，c4抗体(由日本京都大学shimaday博士惠赠，其表位位于stathmin中部，elisa检测结果显示此表位抗体亲和力比c3、c16抗体低，实验数据未显示)比率最低。
商用抗体ab67337小鼠单抗从荧光信号强度和曲线比率都不如本实验室合成的c3、c16抗体。曲线比率低对检测结果的主要影响为，标准曲线区分度降低，假阳性率与假阴性率均高于比率高的抗体。
3)c3和c16抗体在使用alphalisa检测临床样品中的结果
采用上述四种抗体分别检测来自食管鳞癌受试者和健康受试者的临床样品。结果显示(图9a-d)，四种抗体均可以作为alphalisa反应抗体区分疾病与健康人血清，其中c3和c16区分性能更优越，检测灵敏度、特异性优于ab67337小鼠单抗。说明本实验室自制多肽抗体的工作性能优于商用单抗，可能是其抗原表位更有针对性造成的。
此外，实验结果的比较分析(图10a-b)显示，由于c4抗体与商用ab67337抗体的标准曲线斜率低，荧光信号值变化对检测结果影响大，它们对血清stathmin浓度检测结果并不准确，无法相互印证，并且针对单个样品检测结果可能存在较大误差。尤其是截断值(2～3ng/ml)附近，结果相差1ng有可能导致假阳性或者假阴性，因此c3和c16抗体更适合alphalisa实验使用，二者区别不明显，均适用。
序列表
<110>中国医学科学院肿瘤医院
<120>抗stathmin单克隆抗体及其用途
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