本发明属于生物技术领域，具体涉及一种既可以鉴定西瓜杂交种安然纯度又可以鉴定杂交种黄凤凰纯度的ssr引物及方法。
背景技术：
西瓜新品种已实现100%的杂交种，西瓜杂交种的种子纯度是种子质量的主要指标。在西瓜杂交种制种过程中，由于生物学混杂和机械混杂等原因造成杂交种纯度降低现象时有发生，给种子生产造成严重损失，因此为了保护种子生产者、种子经营者及瓜农的利益，研究并建立快速、准确有效的种子纯度鉴定方法是非常重要的。
近年来随着分子生物学的迅速发展，基于dna多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有力工具，因其具有不受环境影响、鉴定周期短、供选择的标记数量多，已大规模用于大田种子纯度鉴定。微卫星（ssr）标记技术具有数量丰富、分布均匀、操作方便、共显性遗传、稳定性好等优点，是进行杂交种纯度鉴定的理想标记类型。西瓜新品种基因组已完成测序，有很多开发的ssr标记。分子标记技术的发展为高效、准确检测西瓜杂交种纯度提供技术支撑。
技术实现要素：
本发明针对目前西瓜杂交种子纯度鉴定靠田间表型观察方法存在受环境影响大、鉴定时间长等缺陷，本发明的第一个目的在于提供一种用于鉴定西瓜杂交种安然及黄凤凰纯度的ssr引物，该引物能够在对应父母本中产生特异性标记，特异性强，能够快速、准确、高效的鉴定西瓜杂交种安然及黄凤凰纯度。本发明的第二个目的在于提供一种用于鉴定西瓜杂交种安然及黄凤凰纯度的方法，该方法利用上述ssr引物，能快速、准确、有效的鉴定西瓜杂交种安然及黄凤凰纯度；
本发明所采用的技术方案是：
一种用于鉴定西瓜杂交种安然与黄凤凰纯度的ssr引物cissr18153，所述引物包括引物cissr18153的上游引物cissr18153-f和下游引物cissr18153-r，所述上游引物cissr18153-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物cissr18153-r的核苷酸序列如seqidno.2所示。
上述引物的具体核苷酸序列如下：
上游引物cissr18153-f：5'-tagcaagcggcaccttattt-3'(seqidno.1)
下游引物cissr18153-r：5'-tgattccttccctcctaacct-3'(seqidno.2)
ssr引物cissr18153位于西瓜6号染色体上，利用所述引物cissr18153进行pcr扩增，在西瓜杂交种安然中能扩增出142bp的父本特异性标记和152bp的母本特异性标记（图1）；在西瓜杂交种黄凤凰中能扩增出152bp的父本特异性标记和142bp的母本特异性标记（图2）。
所述在西瓜杂交种安然中能扩增处152bp的母本特异性标记的核苷酸序列如seqidn0.3所示，所述在西瓜杂交种安然中能扩增出142bp的父本特异性标记的核苷酸序列如seqidn0.4所示；
所述在西瓜杂交种黄凤凰中能扩增出142bp的母本特异性标记的核苷酸序列如seqidn0.5所示，所述在西瓜杂交种黄凤凰中能扩增出152bp的父本特异性标记的核苷酸序列如seqidn0.6所示。
一种用于鉴定西瓜杂交种安然与黄凤凰纯度的方法，包括以下步骤：
（1）提取西瓜杂交种安然或黄凤凰的亲本或其杂交后代的基因组dna；
（2）利用权利要求1-3任一一项所述的引物cissr09643对提取西瓜杂交种安然或黄凤凰的亲本或其杂交后代的基因组dna进行pcr扩增；
（3）对步骤(2)的pcr扩增产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
（4）对步骤(3)电泳检测结果进行分析，真正杂交种的标准图谱为同时具有两个亲本特异性序列的图谱，否则为假杂种，利用统计结果计算杂交种子纯度；其中：
若在西瓜杂交种安然中能扩增142bp的父本特异性标记和152bp的母本特异性标记，则为真正杂交种，否则为假杂种；
若在西瓜杂交种黄凤凰中能扩增152bp的父本特异性标记和142bp的母本特异性标记，则为真正杂交种，否则为假杂种；
利用葫芦科基因组数据库（http://cucurbitgenomics.org/）的西瓜ssr分子标记引物中有目的性的筛选55对ssr引物，将上述55对ssr引物合成后进行引物多态性筛选；筛选的具体过程为：首先提取西瓜杂交种安然或黄凤凰父本和母本的基因组dna，然后分别以父本和母本的基因组dna为模板，55对ssr引物分别逐对进行pcr扩增，扩增完毕后进行8%聚丙稀铣胺凝胶电泳，银染法染色，对每一对引物扩增出来的电泳图谱进行判断，如果某一对引物能够产生母本特异性标记和父本特异性标记，且以f1基因组dna为模板，扩增电泳后同时显示出父母本的特征条带时，我们就确定这一对引物可以用于对应的西瓜杂交种纯度鉴定。最终，我们选择出了一对ssr标记cissr18153，既可以用来鉴定西瓜杂交种安然纯度，也可以用来鉴定西瓜杂交种黄凤凰的纯度。
本发明的有益效果：
1、本发明中的ssr引物cissr18153能产生安然或黄凤凰母本特异性标记和父本特异性标记，且特异性强，遗传稳定。
2、用本发明的引物cissr09643，可将西瓜品种安然与黄凤凰的杂交种子与其对应的父母本种子、其他混杂的种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。
3、通过本发明引物及方法，只需简单提取西瓜叶片基因组dna，然后进行pcr扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定安然与黄凤凰杂交种子的纯度。
4、本发明鉴定方法只需在5h之内即可完成西瓜杂交种安然或黄凤凰纯度鉴定工作，避免了传统田间小区鉴定周期长、费时费工、占地面积大等的不足，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。
附图说明
图1表示利用ssr引物cissr18153扩增安然亲本与f1杂交种的电泳图谱，其中m表示marker，p1表示母本，p2表示父本，f1表示杂交种。
图2表示利用ssr引物cissr18153扩增黄凤凰亲本与f1杂交种的电泳图谱，其中m表示marker，p1表示母本，p2表示父本，f1表示杂交种。
图3表示西瓜杂交种安然父母本测序结果，♀表示母本，♂表示父本，两个重复，其中前20个碱基为前引物序列，后20个碱基为后引物反向序列。
图4表示西瓜杂交种黄凤凰父母本测序结果，♀表示母本，♂表示父本，两个重复，其中前20个碱基为前引物序列，后20个碱基为后引物反向序列。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、材料与方法
1、植物材料
本研究使用安然与黄凤凰的杂交种子及其对应的亲本种子为实验材料，随机选取f1种子各94粒，父母本各1粒，利用常规实验方法进行播种和管理。
2、ssr引物
本研究利用从葫芦科基因组数据库（http://cucurbitgenomics.org/）的西瓜ssr分子标记引物中有目的性的筛选55对ssr引物。
3、基因组dna的提取
利用改良的ctab法，从17-21天左右新鲜植物叶片中提取西瓜基因组dna。具体方法为：①取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中90s，然后利用组织研磨仪磨样；②在磨好的样中加入800µl2%的ctab提取液，55℃水浴20min；③12000rpm离心1min，吸取600µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入300µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；④13000rpm离心1min，取300µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入100%的酒精550µl，混匀，放-20℃冰箱1h；100%的酒精提前在-20℃条件下预冷；⑤12000rpm、离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；⑥待离心管中无酒精味时，加入100µlddh2o溶解dna。
4、pcr扩增及检测
pcr扩增在中国华盛公司ly96gthermocyclertm扩增仪上进行，反应体系为25μl，包括12.5μl2×taqmastermix，1μldna提取物，10μm的正反向引物各1μl，9.5μlddh2o。pcr扩增的程序为：94℃预变性2min，[94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s]，35个循环，72℃延伸2min，然后反应保持在16℃。在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离pcr扩增的片段，银染法染色，并在白光下显现。
5、具有多态性的标记筛选及纯度鉴定
将上述55对ssr引物合成后进行引物多态性筛选，筛选的具体过程为：首先提取西瓜杂交种安然、黄凤凰父本和母本的基因组dna，然后分别以父本和母本的基因组dna为模板，55对ssr引物分别逐对进行pcr扩增，扩增完毕后进行8%聚丙稀铣胺凝胶电泳，银染法染色，对每一对引物扩增出来的电泳图谱进行判断，如果某一对引物能够产生母本特异性标记和父本特异性标记，且以f1基因组dna为模板，扩增电泳后同时显示出父母本的特征条带时，我们就确定这一对引物可以用于对应的西瓜杂交种纯度鉴定。
利用筛选出的多态性强、重复性好的ssr引物来鉴定西瓜杂交种安然与黄凤凰的纯度。杂交种子标准电泳图谱为同时具有父母本特异性标记的图谱。
二、结果分析
利用选取的55对西瓜ssr引物对亲本dna进行扩增、电泳，筛选有多态性的引物。成功选取到一对ssr标记cissr18153，既可以用来鉴定西瓜杂交种安然纯度，也可以用来鉴定西瓜杂交种黄凤凰的纯度。
通过该ssr引物cissr18153扩增电泳后，可清晰区分安然父母本的电泳图谱（图1）及黄凤凰亲本电泳图谱（图2）。将安然、黄凤凰父母本的pcr扩增产物进行测序，测序结果分别见图3、图4，发现在安然母本中扩增出152bp的序列（seqidn0.3），父本中扩增出142bp的序列（seqidn0.4）；在黄凤凰母本中扩增出142bp的序列（seqidn0.5），父本中扩增出152bp的序列（seqidn0.6）。
上述ssr引物cissr18153的序列为：
上游引物cissr18153-f：5'-tagcaagcggcaccttattt-3'(seqidno.1)
下游引物cissr18153-r：5'-tgattccttccctcctaacct-3'(seqidno.2)
将f1电泳图谱与杂交种标准图谱比较分析，发现安然、黄凤凰的94个f1电泳图谱均与杂交种子电泳图谱一致，为同时具有父母本特异性标记的图谱，说明所选西瓜杂交种安然、黄凤凰的纯度均达到了100%。所用ssr标记cissr18153既可以高效稳定的鉴定西瓜杂交品种安然的纯度也可以鉴定杂交种黄凤凰的纯度。
序列表
<110>江苏绿港现代农业发展有限公司
<120>一种用于鉴定西瓜杂交种安然与黄凤凰纯度的ssr引物及方法
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
tagcaagcggcaccttattt20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
tgattccttccctcctaacct20
<210>3
<211>152
<212>dna
<213>西瓜（citrulluslanatus(thunb.)matsum.&nakai）
<400>3
tagcaagcggcaccttatttttctatggattggctcctttgcctatttcgtcatagagaa60
aaattaatgggtagtttgtattgcattgagtagggaagagaacagaagagaagagaagag120
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<210>4
<211>142
<212>dna
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<213>西瓜（citrulluslanatus(thunb.)matsum.&nakai）
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