本发明属于不结球白菜分子辅助育种领域，涉及bcggp基因的indel分子标记引物及应用；具体涉及一种辅助选择不结球白菜抗坏血酸含量bcggp基因的indel分子标记引物及其应用。
背景技术：
抗坏血酸(l-ascorbicacid,asa)，又叫维生素c，是动植物体中的一种多功能代谢物质，也是维持动植物生命活动所必须的营养物质。由于人类和一些灵长类动物因自身无法合成抗坏血酸，只能通过蔬菜和水果中获取。不结球白菜是我国最重要的蔬菜作物之一，起源于长江中下游，具有悠久的栽培历史，因其具有较强的适应性和较短的生长周期以及丰富的营养品质，在南亚，日本，美国，欧洲等地广泛种植，成为重要的世界型蔬菜。不结球白菜不同品种间asa含量差异明显，提高不结球白菜的asa含量是重要的育种目标之一。借助分子标记辅助育种可以加快育种进程，因此开发抗坏血酸含量相关的分子标记对于提高不结球白菜的品质具有重要意义。
l-半乳糖途径是植物抗坏血酸合成的主要途径，t-dna插入或敲除该途径上的基因均能降低叶片中asa的含量而过表达l-半乳糖途径中的大多数基因，对asa含量却有较低的影响，但是过表达gdp-l-半乳糖磷酸化酶(ggp)基因却能够使烟草叶片的asa含量提高2倍,拟南芥叶片的asa含量提高三倍，在马铃薯，番茄，以及草莓中均已证明ggp的过表达可以增加asa的含量。苹果中asa相关的qtl分析表明ggp的等位变异是调控抗坏血酸含量的主要决定因素。表明ggp基因在抗坏血酸合成中发挥重要的作用。本发明在不结球白菜不同品种重测序的基础之上，检测到bcggp基因的等位变异，开发了bcggp的indel分子标记；并且选用抗坏血酸含量高的乌塌菜品种和抗坏血酸含量低的二青为亲本，在100份重组自交系群体上验证了该标记的可靠性。该标记的开发，具有操作简单、成本低廉、周期短的优点,而且该标记的稳定性好,不受其它基因效应和环境因素的影响,可在早代选择,缩短育种年限,提高育种效率,对不结球白菜提高抗坏血酸含量的品种改良具有重要意义,适用于基因的辅助选择育种。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是开发出高抗坏血酸含量的不结球白菜bcggp基因的分子标记及其引物，能够用于不结球白菜抗坏血酸含量分子标记辅助选择育种。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
不结球白菜bcggpindel分子标记的方法，包括：
抗坏血酸合成基因gdp-l-半乳糖磷酸化酶(ggp)在不结球白菜中携带等位变异，根据该基因的等位变异开发的bcggpindel的分子标记上下游引物分别为：
bcggpindel-f：agaacaacatccctttcaac(seqidno.1)；
bcggpindel-r：taatcctctttcctcttcag(seqidno.2)
利用这对引物扩增不结球白菜乌塌菜品种和二青品种以及获得的分离群体内的单株，扩增结果为三种形式的片段，长片段表示indel的插入，记为in，与乌塌菜的扩增结果一致，一般为高抗坏血酸含量的植株；短片段表示indel的缺失，记为del，与二青的扩增结果一致，一般为低抗坏血酸含量的植株；两种片段都有的为杂合片段，记为h，一般为高抗坏血酸含量的植株。bcggpindel分子标记与不结球白菜的抗坏血酸含量显著相关，从而可以应用于不结球白菜抗坏血酸含量的分子标记辅助选择。
不结球白菜bcggp的indel分子标记引物，由以下引物组成：bcggpindel-f：seqidno.1；bcggpindel-r：seqidno.2。
本发明所述的分子标记在不结球白菜抗坏血酸含量的分子标记辅助选择中的应用。
本发明所述的不结球白菜bcggp的indel分子标记引物在不结球白菜抗坏血酸含量的分子标记辅助选择中的应用。
本发明相比现有技术，具有以下有益效果：
(1)该indel标记可以使用与ssr标记相同的分离和检测技术进行分析，便于应用，并且比snp标记更加方便检测和分析，具有稳定性。
(2)辅助选择方便，节约成本。不结球白菜高vc含量品种的常规选育方法一般周期长，成本高，费时又费力。通过本发明获得的bcggpindel分子标记用于辅助选择，可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球白菜高vc含量系的选择效率，从而加快育种进程。
附图说明
图1bcggp基因的indel分子标记的基因分型
图2不同基因型的ril群体所对应的抗坏血酸含量
具体实施方式
本发明的实施程序是：
步骤1，根据重测序提供的位点和bcggp基因dna全长克隆的测序结果，确定了在bcggp基因的第5个内含子处存在gaaaataaat的indel插入位点。
步骤2，距离该indel位点100bp处设计特异性引物，bcggpindel序列的上游引物为bcggpindel-f：agaacaacatccctttcaac；下游引物为bcggpindel-r：taatcctctttcctcttcag片段长度约200bp，pcr扩增产物经聚丙烯凝胶电泳进行基因分型。电泳条带的差异可以用于区分基因型，长片段记为in，短片段记为del，杂合条带记为h(图1)
步骤3，在乌塌菜与二青为亲本获得的f6的重组自交系群体中对bcggp基因的indel分子标记进行基因分型和关联分析。结果验证了在100份重组自交系群体中，检测为in基因带型且与亲本乌塌菜具有相同带型的有41份，平均asa含量为67.32mg/100g；为del基因型且与亲本二青具有相同带型的有39份，平均asa含量为39.79mg/100g；检测为有两条带型的h基因型为5份，平均抗坏血酸含量为63.70mg/100g(图2)。显著性差异分析(p＝0.0018，p<0.01)，为极显著差异。标记基因型与asa含量表型的person相关性分析表明，材料asa含量与标记基因型在0.1水平上显著相关。
序列表
<110>南京农业大学
<120>bcggp基因的indel分子标记引物及应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agaacaacatccctttcaac20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
taatcctctttcctcttcag20