一种前列腺上皮细胞恶变诱导方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种前列腺上皮细胞恶变诱导方法以及用于前列腺上皮细胞恶变诱导的试剂盒。

背景技术：

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，发病随年龄增长而增加，全球范围内居男性恶性肿瘤发病率的第1位，病死率的第2位。随着饮食结构变化、人口老龄化及前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen，psa)检测的普及，近年来发病率依然呈持续快速上升趋势，且初诊患者中，中晚期比例较高，已成为影响男性健康的重要疾病之一。因此，构建适宜的细胞模型用于前列腺癌临床基础研究一直是热点课题之一，现在已有多种分离自前列腺原发灶、转移灶以及诱导间变的前列腺癌细胞模型。然而，目前还没有报道诱导良性前列腺上皮细胞恶性转化的的技术。

bph-1是一种临床及基础科研的常用细胞系，来自经尿道前列腺电切术的人类前列腺增生组织，经sv40永生化处理后广泛用于前列腺增生的研究，与正常前列腺上皮细胞相比，该细胞具有生长迅速、成瘤率高的特点，此外，作为前列腺增生模型细胞，其代谢机制、生长方式及生物学表现与正常前列腺上皮细胞明显不同，因此，在前列腺癌研究领域，bph-1通常与正常前列腺上皮细胞(rwpe-1)共同作为良性细胞与肿瘤细胞进行对照。

此外，在申请人之前的大样本二代测序研究中，发现pitx3基因在65对前列腺癌患者组织中呈相对低表达，该基因编码的pitx3蛋白属于rieg/pitx3同源框家族成员，位于10号染色体长臂上，结构域上属bicoid组。该家族具有转录因子活性，表达于骨骼肌与睾丸中，已有报道该蛋白参与眼发育中的晶体形成以及中脑黑质致密部多巴胺能神经元的终末分化，该基因的丢失与帕金森症和先天性白内障有关。

目前尚未有人将pitx3基因在前列腺癌患者组织中呈相对低表达和bph-1细胞系联系起来，并且也缺乏一种由良性细胞转化而来的恶性细胞模型，尚未有报道诱导良性前列腺上皮细胞恶性转化的技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种前列腺上皮细胞恶变诱导方法以及用于前列腺上皮细胞恶变诱导的试剂盒，通过良性细胞转化而来恶性细胞模型，并应用于前列腺癌临床基础研究。

本发明的第一方面提供了前列腺上皮细胞恶变诱导方法，该方法也即前列腺上皮细胞恶变裸鼠模型的构建方法。

本发明的技术方案为：先构建敲除pitx3基因的bph-1细胞系，然后将得到的细胞系转移至裸鼠使裸鼠产生病灶，而后将裸鼠的病灶取出进性病灶细胞原代培养，最后将培养出的原代细胞注射入健康裸鼠内进行肿瘤诱导，得到恶变肿瘤模型。具体包括以下步骤：

a.构建敲除pitx3基因的bph-1细胞系，获得敲除pitx3的bph-1的细胞pitx3-bph-1；

b.构建pitx3-bph-1细胞转移裸鼠模型

将pitx3-bph-1细胞消化分散后采用pbs重悬，按照每只裸鼠5×10⁵～10×10⁵个的细胞数量级给每只裸鼠尾静脉注射100～200μl细胞悬液，每周通过luciferin小动物成像观察转移情况直至发生器官转移且转移灶细胞浓度大于10⁶p/sec/cm²/sr；

c.转移灶细胞原代培养

将器官转移灶去除转移灶附带杂质组织并反复清洗后，将器官转移灶剪切成碎块；向转移灶碎块中加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化液，消化后用接种液洗几次，而后用接种液混悬，反复吹打混旋液中的组织块至浑浊后将上清液移入培养瓶待用；向所述培养瓶中加入接种液，再次吹打，反复几次后使组织块逐渐消化，收集含单细胞悬液的上清液于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，并进行细胞计数；

接种一定数量的细胞于多孔培养板中，培养18～30小时至细胞贴壁后，换全培养液，培养3～5天后根据bph-1细胞的生长状况，换用卡那霉素培养液培养3～5天抑制杂细胞生长，获得单纯培养的原代转移灶细胞，而后每隔3～5天换全培养液1次，每次换半液；

d.恶变诱导

将原代转移灶细胞消化分散后用pbs重悬，按照每只裸鼠5×10⁶～10×10⁶个的细胞数量级给每只老鼠皮下注射100～200μl细胞悬液，培养2～3周后获得诱导肿瘤裸鼠。

本发明中，步骤b中裸鼠的器官转移灶可以是肺转移灶、肝转移灶等多种器官转移灶，最先出现病灶的器官是肺，所以本发明实施例部分的操作是根据肺转移灶进行的。

优选的，步骤a中构建敲除pitx3基因的bph-1细胞系的方法为：

将pitx3基因包装为cas9-guiderna慢病毒，与商品化crispr-cas9病毒、luciferace病毒各1～2μg共同转染bph-1细胞，感染2～3天后，加入puromycin筛选4～6天，得到感染成功的敲除pitx3的bph-1的细胞pitx3-bph-1。

crispr-cas9系统来自streptococcuspyogenes，含有两个核酸酶结构域，可以分别切割dna两条单链。cas9首先与crrna及tracrrna结合成复合物，然后通过pam序列结合并侵入dna，形成rna-dna复合结构，进而对目的dna双链进行切割，使dna双链断裂。由于pam序列结构简单(5-ngg-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。

luciferace病毒用于转染后成像，该病毒的存在使得转染小鼠可以直接通过成像系统直接进行转染程度检测。

此外，本发明中，将pitx3基因包装为cas9-guiderna慢病毒以及将三种病毒共同进行转染由和元生物技术(上海)股份有限公司完成。

优选的，cas9-guiderna慢病毒的序列如seqidno:1所示，为cccgacatgagcacgcgcg。

优选的，步骤c中，向转移灶碎块中加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化液后，在37℃培养箱中消化30～40min，而后将组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液后，用接种液冲洗。

优选的，接种液为dmem液体培养基，全培养液为含有体积分数为10％fbs胎牛血清的dmem液体培养基，卡那霉素培养液的终浓度为2.5ug/ml，换半液。

优选的，步骤c中，当观察bph-1细胞稳定贴壁后，开始换用卡那霉素培养液。

优选的，器官转移灶为肺转移灶。

本发明的第二方面，提供了一种前列腺上皮细胞恶变诱导试剂盒。

试剂盒包括bph-1细胞基因敲除系统、器官转移灶原代细胞培养系统以及裸鼠注射系统，bph-1细胞基因敲除系统包括慢病毒转染及检测试剂。

本发明的有益保障及效果：

申请人为医院，能够取得大量的前列腺癌病人的肿瘤标本，为本发明的研究提供了有力的保障。

就技术而言，本发明前列腺上皮细胞恶变诱导方法本质上是bph-1细胞系的基因敲除以及器官转移灶的原代细胞培养，该两种技术均日趋成熟，具有操作简便、重复性强、准确率高等特点，不存在诱导过程难操作的问题。

此外，由于原代细胞离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，生物性状尚未发生很大的改变，并且原代细胞的致瘤能力强，经恶变诱导容易产生恶变程度高的肿瘤模型，其临床参考价值和可信度较高，实现了良性细胞转化成恶性细胞模型，可用于前列腺癌临床基础研究。

附图说明

图1为转移灶细胞的流式检测结果图。

图2为转移灶细胞侵袭能力检测结果图。

图3为转移灶细胞增殖能力检测结果图。

图4为转移灶细胞增值能力流式分析图。

图5为转移灶细胞诱导裸鼠成瘤能力示意图，其中1-5为转移灶细胞，6为bph。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：前列腺上皮细胞恶变诱导

(1)获得敲除pitx3的bph-1细胞系

将pitx3基因包装为cas9-guiderna慢病毒，序列为cccgacatgagcacgcgcg(seqidno:1)，与商品化crispr-cas9病毒、luciferace病毒各2μg共同转染bph-1细胞，感染3天后，加入puromycin筛选4天，得到感染成功的敲除pitx3的bph-1细胞pitx3-bph-1。

(2)构建pitx3-bph-1细胞转移裸鼠模型

将pitx3-bph-1细胞消化分散后采用pbs重悬，按照每只裸鼠5×10⁵～10×10⁵个的细胞数量级给每只裸鼠尾静脉注射100～200μl细胞悬液，每周通过luciferin小动物成像观察转移情况直至发生器官转移且转移灶细胞浓度大于10⁶p/sec/cm²/sr。

(3)取出肺转移灶行原代细胞培养

取肺叶组织漂洗，预冷解剖液中分离去除胸膜、血管、支气管、肺门结缔组织等杂质组织，而后将肺叶反复剪切成碎块。

吸除解剖液加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液2ml，37℃培养箱中消化30min后将肺组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液，最后再用接种液1ml混悬，反复吹打混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用，而后加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块，收集含单细胞悬液的上清液5ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，并进行细胞记数。

接种1×10⁷～2×10⁷个细胞于6孔培养板中，培养24h至细胞贴壁后，换全培养液(dmem+10％fbs，gibco)，培养3d后观察bph-1细胞贴壁后，换用卡那霉素培养液至终浓度2.5ug/ml，换半液，培养3d以抑制杂细胞生长，获得单纯培养的原代转移灶细胞，每隔3d换全培养液1次，每次换半液。

(4)恶变诱导

将转移灶细胞消化分散下来，pbs重悬，按照每只裸鼠5×10⁶的数量级每只老鼠皮下注射100μl细胞悬液，培养3周获得诱导肿瘤裸鼠。

本实施例以肺转移灶行原代细胞培养，也可以是其他器官转移灶，原代细胞培养的条件根据肺转移灶原代细胞培养条件进行微调即可。

此外，根据上述步骤，本实施例还提供了一种前列腺上皮细胞恶变诱导试剂盒，该试剂盒包括bph-1细胞基因敲除系统、器官转移灶原代细胞培养系统以及裸鼠注射系统，将整个过程所需的试剂、小器械归纳在一起。

实施例2：转移灶细胞转染检测

将转移灶细胞消化分散下来，待细胞计数后，向流式检测管中加入约10⁶个数的转移灶细胞；用pbs洗涤细胞后加入100ulpbs混悬细胞，并向不同的流式管中加入不同的流式抗体各1ul，包括cd105、cd73、cd90、cd44、cd34、cd45、cd11b，在涡旋振荡器上混匀后放在4℃冰箱内孵育30分钟；孵育结束后，用pbs洗涤细胞并离心以除去没有结合的流式抗体；最后向管中加入300ulpbs流式检测。

使用flowjo软件对数据进行分析，具体结果如图1所示，结果显示fitc染色为cd34、cd105，pe染色为cd44、cd73，细胞转染成功。

实施例3：转移灶细胞侵袭能力检测

将transwell小室置于24孔板上，将小室拿起，在孔中加入含10％血清的培养基，再将小室置于板上，将5×10⁴个转移灶细胞铺于每个小室中，在小室内加入无血清培养基，盖上盖子培养72h，待细胞穿至小室下层后，吸尽上下层培养基，揭开盖子，擦去小室上层细胞将小室拿起，在下层加入多聚甲醛后放上小室固定15min后，再以结晶紫染色30min，洗净后将小室拿起后倒置风干，可在显微镜下观察、拍照，并以bph细胞作为对照。

如图2所示，与bph细胞相比，转移灶细胞的颜色深的多，说明转移灶细胞的侵袭能力较强。

实施例4：转移灶细胞增殖能力检测

每孔1×10⁶个转移灶细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段，设置1个不加edu培养基的对照组，以便进行流式检测数据的染料背景分析。

用细胞培养基按1000:1的比例稀释edu溶液(试剂a)，制备适量50μmedu培养基，细胞培养基更换为edu培养基，每孔加入1ml，孵育2小时，将细胞收集至流式管中，1500rpm离心5min，弃上清，用pbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，4％多聚甲醛固定15min后，2mg/ml甘氨酸中和5min，pbs清洗1次，0.5％tritonx-100渗透剂室温孵育10min，pbs清洗1次，每管加入500μl的1×染色反应液，重悬细胞，避光、室温孵育10min后，1500rpm离心5min，弃染色反应液，0.5％tritonx-100渗透剂室温清洗3次，pbs重悬，进行流式检测。结果如图3和图4所示，转移灶细胞的增殖能力明显强于pbh细胞。

实施例5：转移灶细胞成瘤能力检测

将转移灶细胞消化分散下来，pbs重悬，按照每只裸鼠5×10⁶的数量级每只老鼠皮下注射100μl细胞悬液，每周观察成瘤情况直至成瘤，每周以游标卡尺测量肿瘤各径线并拍照，待肿瘤长至约2cm×2cm×2cm以上时处死裸鼠，剥下肿瘤切片行免疫组化he染色观察组织恶性程度，并以接种bph细胞裸鼠作为对照，具体结果如图5所示。

如图5所示，1-5为转移灶细胞，6为bph细胞。与bph细胞相比，转移灶细胞的成瘤能力明显较优。

以上已对本发明的实例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110>上海长海医院

<120>一种前列腺上皮细胞恶变诱导方法及试剂盒

<130>说明书；权利要求书

<141>2018-04-28

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cccgacatgagcacgcgcg19