本发明属于生物技术领域，涉及一种靶向cdkn2a的cell-in-cell(cic)细胞模型及其制备方法。
背景技术：
cell-in-cell(cic)结构是指一个或多个活细胞位于另一个细胞内部所形成的独特的细胞叠套样结构。cic现象广泛存在于各物种当中，包括低等生物阿米巴原虫，到后生生物秀丽线虫以及哺乳动物系统中。根据形成cic结构的细胞种类不同，可分为同质cic，如形成于来源相同的肿瘤或上皮细胞之间的cic结构；和异质cic，形成于来源不同的细胞之间的cic结构。
目前，肿瘤是同质cic结构生物学意义研究最为活跃的领域。临床组织样本的研究报道，cic现象常见于人类肿瘤组织中，如乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌等，而鲜见于正常组织中。由于同质cic结构的形成能介导内部细胞死亡，因此，有学者认为同质cic实质上是一种细胞死亡机制，可清除脱离细胞外基质的细胞或恶性转化的细胞，可见肿瘤细胞间cic结构的形成有利于杀死肿瘤细胞，限制肿瘤生长。
现有的cic研究中存在缺乏由特定基因调控的细胞模型，难以获得体外研究体系，不能实现靶向特定基因等缺陷。
技术实现要素：
本发明的发明人首次发现，抑癌基因cdkn2a在细胞内表达降低可以促进cic结构的形成，进而介导内部细胞死亡，实现杀死细胞的目的。该模型既适用于非肿瘤细胞系也适用于肿瘤细胞系。
第一方面，本发明要求保护一种制备cell-in-cell相关细胞模型的方法。
本发明所提供的制备cell-in-cell相关细胞模型的方法，是通过调控靶细胞中cdkn2a基因的表达来制备得到cell-in-cell相关细胞模型。
其中，所述靶细胞既可以为肿瘤细胞，也可以为非肿瘤细胞。所述靶细胞可为人源细胞。
进一步地，所述方法可为如下方法a或方法b：
方法a：制备诱导cell-in-cell细胞模型的方法，可包括如下步骤：抑制所述靶细胞中cdkn2a基因的表达。
方法b：所述方法为制备抑制cell-in-cell细胞模型的方法，可包括如下步骤：使所述靶细胞中过量表达cdkn2a基因。
更进一步地，在所述方法a中，所述靶细胞可为cdkn2a基因有效表达的细胞(如通过westernblot能检测出cdkn2a基因编码蛋白的表达)。在所述方法b中，所述靶细胞可为cdkn2a基因表达或功能缺失的细胞(如通过westernblot无法检测到cdkn2a基因编码蛋白的表达)。
在本发明的具体实施方式中，在所述方法a中，所述靶细胞具体为hek293细胞(正常人胚肾细胞)。在所述方法b中，所述靶细胞具体为mcf10a细胞(非转化乳腺上皮细胞系)或mcf7细胞(乳腺癌细胞系)。
更进一步地，在所述方法a中，所述“抑制所述靶细胞中cdkn2a基因的表达”可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如crispr/cas9核酸酶)对cdkn2a基因进行特异性剪切，从而降低其在所述靶细胞中的表达；或通过化合物抑制cdkn2a基因表达的蛋白质功能，如cdkn2a抑制剂。
在本发明的具体实施方式中，在所述方法a中，抑制所述靶细胞中cdkn2a基因的表达具体是通过crispr/cas9技术实现的。具体是以cdkn2a基因序列中符合5’-gn19-ngg-3’序列排列规则的片段为靶序列；n表示a、g、c和t中的任一种，n19表示19个连续的脱氧核糖核苷。若靶位点范围内无法找到符合5’-gn19-ngg-3’排列规则的序列，则寻找5’-n20-ngg-3’，并在sgrna前加g，即5’-g-n20-ngg-3’。相应的，所述靶序列所对应的两条互补的sgrnaoligo具体为seqidno.1和seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4，或者seqidno.5和seqidno.6。
更进一步地，在所述方法b中，使所述靶细胞中过量表达cdkn2a基因是通过如下方式实现的：使所述靶细胞中过量表达cdkn2a基因的四个转录本中至少一个，所述cdkn2a基因的四个转录本为p16ink4a、p16γ、p12以及p14arf。
在本发明的具体实施方式中，使所述靶细胞中过量表达cdkn2a基因的转录本p16ink4a具体是通过向所述靶细胞中导入含有所述转录本p16ink4a的编码基因的重组表达载体实现的；使所述靶细胞中过量表达cdkn2a基因的转录本p16γ具体是通过向所述靶细胞中导入含有所述转录本p16γ的编码基因的重组表达载体实现的；使所述靶细胞中过量表达cdkn2a基因的转录本p12具体是通过向所述靶细胞中导入含有所述转录本p12的编码基因的重组表达载体实现的；使所述靶细胞中过量表达cdkn2a基因的转录本p14arf具体是通过向所述靶细胞中导入含有所述转录本p14arf的编码基因的重组表达载体实现的。
其中，所述重组表达载体为以逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1为骨架，构建cdkn2a过表达载体。所述cdkn2a基因的四个转录本被分别插入到所述逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1的ecori和mfei之间，得到4个所述重组表达载体。
在本发明中，所述cdkn2a基因的核苷酸序列如genbank：nc_000009.12的第21967752-21995043位所示(complement，2018-3-26)。所述转录本p16ink4a的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.7所示。所述转录本p16γ的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.8所示。所述转录本p12的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.9所示。所述转录本p14arf的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.10所示。
在本发明中，所述cell-in-cell的种类具体为同质cell-in-cell(即同种细胞之间所形成的cell-in-cell结构)。
第二方面，本发明要求保护由前文所述方法制备得到的细胞模型。
第三方面，本发明要求保护所述细胞模型在如下任一中的应用：
(a1)通过所述细胞模型评价待测物(如特定化合物、提取物、小分子、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)对肿瘤生长等疾病进程的影响；
(a2)将待测物(如特定化合物、提取物、小分子、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)靶向所述细胞模型从而评价所述待测物的生物安全性；
(a3)利用所述细胞模型制备肿瘤治疗药物；如用于通过cell-in-cell建立新的疾病(如肿瘤)治疗手段，包括可用于治疗的细胞、核酸、蛋白质和小分子等；
(a4)通过或借助所述细胞模型建立新的动物模型。
实验证明，使用正常人胚肾细胞hek293(该细胞有效表达cdkn2a)，采用crispr/cas9系统，通过设计sgrna敲低内源性cdkn2a的表达，可促进cic结构形成。使用cdkn2a表达缺陷的非转化乳腺上皮细胞系mcf10a以及乳腺癌细胞系mcf7，通过逆转录病毒载体转染重新表达cdkn2a可获得抑制cic细胞模型。利用本发明所提供的这种通过干预cdkn2a基因表达促进cic结构形成的方法。针对cdkn2a表达有效的肿瘤细胞，通过该方法有望促使cic介导的胞内死亡，实现杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的目的。
附图说明
图1为westernblot检测各细胞系中cdkn2a的表达水平。
图2为cell-in-cell结构的免疫荧光示意图。
图3为靶向敲低cdkn2a基因促进cell-in-cell结构形成。a：westernblot检测三个不同靶点的cdkn2a-sgrna的敲低效率；b：cell-in-cell形成率。**p<0.01；c：pcs-cdkn2a-sgrna表达质粒的测序结果。
图4为过表达cdkn2a四个不同转录本抑制cell-in-cell结构形成。a：非转化乳腺上皮细胞系mcf10a；b：乳腺癌细胞系mcf7。**p<0.01。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
hek293细胞：atcc细胞库，#crl-1573。
cas9工作系统质粒precutpcs(puro)：生物工程研究所郗永义博士赠送，购于北京百奥赛图公司。
逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1：记载于“wangm,ningx,chena,huangh,nic,zhouc,etal.impairedformationofhomotypiccell-in-cellstructuresinhumantumorcellslackingalpha-cateninexpression.scientificreports.2015；5:12223”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
pcmv-vsv-g质粒：addgene，#8454。
gag/pol质粒：addgene，#14887。
293ft细胞：北纳生物细胞库，bncc339263。
mcf10a细胞：记载于“wangm,ningx,chena,huangh,nic,zhouc,etal.impairedformationofhomotypiccell-in-cellstructuresinhumantumorcellslackingalpha-cateninexpression.scientificreports.2015；5:12223”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
mcf7细胞：记载于“wangm,ningx,chena,huangh,nic,zhouc,etal.impairedformationofhomotypiccell-in-cellstructuresinhumantumorcellslackingalpha-cateninexpression.scientificreports.2015；5:12223”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
实施例1、诱导cic细胞模型的建立
本实施例中的靶细胞为hek293细胞，westernblot能检测出hek293细胞中cdkn2a基因编码蛋白的表达(图1)，具体检测方法参见本实施例步骤一6中westernblot。
一、hek293/cdkn2a-cas9敲低细胞系的建立
1、设计sgrnaoligo
根据靶序列后加pam序列原则，以cdkn2a基因(genbank：nc_000009.12的第21967752-21995043位所示，complement，2018-3-26)为靶序列，设计3条cdkn2a-sgrna如下：
sgrna-1：5’-caccgcaccgaatagttacggtcgg-3’(seqidno.1)；
5’-aaacccgaccgtaactattcggtgc-3’(seqidno.2)。
sgrna-2：5’-caccgaccgtaactattcggtgcgt-3’(seqidno.3)；
5’-aaacacgcaccgaatagttacggtc-3’(seqidno.4)。
sgrna-3：5’-caccgtgggccatcgcgatgtcgca-3’(seqidno.5)；
5’-aaactgcgacatcgcgatggcccac-3’(seqidno.6)。
2、构建表达cdkn2a-sgrna的质粒
引物合成后，将sgrnaoligo用ddh2o溶解，终浓度为100μm，两条互补的sgrnaoligo各取15μl混合，放入沸水浴中煮5min后待其自然降温至室温即退火完成；然后通过bbsⅰ酶切cas9工作系统质粒precutpcs(puro)，使其线性化，将酶切载体与退火的sgrna进行连接，获得表达cdkn2a-sgrna的质粒pcs-cdkn2a-sgrna，并经测序验证证实构建正确。
3、铺细胞
先将hek293细胞以每孔1×106个细胞的密度均匀铺于预先用胶原(collageni)包埋的六孔板，补齐培养基dmem(含10％fbs，％表示体积百分含量)至2ml，放入培养箱培养16h后进行转染实验。
4、脂质体转染体系
a液：将0.4μg目的质粒pcs-cdkn2a-sgrna与100μlopti-mem充分混匀，室温静置5min；b液：将转染试剂lipo2000轻轻颠倒混匀，取2.5μllipo2000稀释至100μlopti-mem中，轻轻颠倒混匀，室温静置5min；c液：将a液与b液混合，轻轻混匀，室温静置30min；将800μlopti-mem与200μl的c液混合获得转染混合液d。
5、转染细胞
弃掉hek293的原培养基，沿孔板内壁轻轻地加入混合好的1mld液。培养5-6h后弃转染液，更换为含10％(体积百分含量)fbs的正常培养基继续培养。
6、加压筛选
细胞于转染24h使用终浓度1μg/m嘌呤霉素加压筛选5天，获得hek293/cdkn2a-cas9敲低细胞系。并通过westernblot检测三个不同靶点的cdkn2a-sgrna的敲低效率。
westernblot检测步骤如下：提取目的细胞蛋白，于冰上加入细胞裂解液放置30min，期间使用旋涡振荡器震荡2～3次使细胞充分裂解，4℃12,000r/min离心20min收集上清并进行蛋白定量。提取的蛋白经95℃变性5min，采用15％的sds-page胶，上样量10μg，100v转膜40min，5％bsa室温封闭1h，根据蛋白分子量大小进行裁膜，分别加一抗anti-e-cadherin抗体(bd；#610182)、anti-β-tubulin抗体(cwbio；#cw0256)和anti-p16ink4a抗体(boster；#bm1592)，于4℃孵育过夜，tbst清洗3次×10min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，tbst清洗3次×10min，最后通过化学发光法检测目的条带。为保证上样量一致，以tubulin条带作为内参对照。
二、cell-in-cell形成实验
1、准备软琼脂
使用预热的pbs缓冲液配制0.5％(0.5g/100ml)的软琼脂溶液，迅速以1ml/孔的量加入至细胞培养六孔板中，轻轻晃动孔板使软琼脂溶液均匀平铺于板底。于室温水平静置数小时，待其凝固。
2、细胞悬浮培养
使用胰酶将细胞消化成单细胞悬液，以每孔计数2×105个细胞铺于凝固的软琼脂上，将培养基补齐至2ml/孔，置于细胞培养箱中悬浮培养13h。
3、细胞甩片
悬浮培养13h后显微镜下可观察到细胞悬浮成团的现象，将细胞悬液轻轻吸出，置于离心管中800rpm离心4min，弃上清，使用1mlpbs重悬，用枪吹打10-20次使其成单细胞悬液，迅速取200μl加入至甩片机中以500rpm转速甩片4min将细胞甩至载玻片上。
4、制片
甩好的片子使用4％多聚甲醛于室温固定10-15min，pbs洗2次，每次5min，轻轻将玻片上的水擦拭干净，0.2％tritonx-100/pbs透膜4min，pbs清洗2次×5min；使用5％牛血清白蛋白室温封闭1h；封闭完毕后加入一抗anti-e-cadherin抗体(1：400稀释；bd；#610182)，于湿盒4℃孵育过夜；第二天用pbs清洗3次×10min；加荧光素标记的二抗(1:500稀释)，于干盒室温孵育1h；pbs清洗3次×10min，用含dapi封片剂进行封片保存，转盘激光共聚焦显微镜(perkinelmer)观察并拍照记录。
5、cell-in-cell统计
荧光显微镜下观察细胞形态及cell-in-cell形成情况，每个片子随机选取四个均匀的视野，各视野至少统计200个细胞(不包括钻入的细胞)。根据dapi标记细胞核识别细胞，以被外部细胞完全包裹的结构记为1个cell-in-cell结构。
cell-in-cell(％)＝形成cell-in-cell的细胞数/总细胞数×100的平均值±sd。
cell-in-cell结构如图2所示，蓝色荧光表示细胞核，红色荧光标记细胞膜蛋白e-cadherin，用于区分细胞与细胞间的边界。统计结果表明，通过sgrna敲低cdkn2a基因，可显著促进细胞cell-in-cell结构形成(图3)。
实施例2、抑制cic细胞模型的建立
本实施例中的靶细胞为mcf10a细胞和mcf7细胞，westernblot无法检测出mcf10a细胞和mcf7细胞中cdkn2a基因编码蛋白的表达(图1)，具体检测方法参见本实施例步骤一6中westernblot。
一、mcf10a/cdkn2a过表达细胞系的建立
以逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1为骨架，构建cdkn2a过表达载体，包括其四个不同转录本p16ink4a、p16γ、p12和p14arf。转录本p16ink4a的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.7所示。转录本p16γ的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.8所示。转录本p12的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.9所示。转录本p14arf的编码基因的核苷酸序列具体如seqidno.10所示。利用限制性核酸内切酶ecori和mfei通过双酶切将逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1线性化，然后将各转录本的编码基因(人工合成时两端加上相应的酶切位点)分别插入到逆转录病毒载体pqcxip-egfp-n1中，得到对应于四个转录本的四个重组逆转录病毒载体，并经测序验证证实构建正确。
然后，通过逆转录病毒包装和感染的方法，将目标载体导入mcf10a细胞，具体实验步骤如下：先将病毒包装细胞293ft以每孔1×106个的密度均匀铺于预先用胶原(collageni)包埋的六孔板，补齐培养基dmem(含10％fbs，％表示体积百分含量)至2ml，放入培养箱培养16h后进行转染实验；逆转录病毒包装体系由0.4μg目的载体(前文构建的四个重组逆转录病毒载体)、0.2μgpcmv-vsv-g质粒、0.25μggag/pol质粒以及脂质体转染试剂lipo2000构成；将病毒包装体系感染细胞使其产病毒，分别于转染后24h、48h、72h收取病毒上清，每次收取病毒上清后补加2ml新鲜的正常培养基；将病毒上清2000rpm离心5min，收集上清，分装并冻存于-80℃备用。
感染细胞前，先将靶细胞mcf10a按1×105/孔接种于六孔板，待8～12h细胞贴壁完全后，取上述病毒上清1ml与500μl新鲜的完全培养基混合，并加入2μl聚凝胺polybrene(储存浓度10μg/ml)，混匀后加入六孔板中感染细胞，感染6h后更换为2ml新鲜培养基继续培养；细胞于感染后24h使用终浓度为2μg/ml嘌呤霉素加压筛选5天，以空白对照组细胞完全死亡以及阳性对照组gfp表达率为100％为判定标准，获得稳定表达cdkn2a的细胞株。
mcf7/cdkn2a过表达细胞系建立方法同上，嘌呤霉素筛选浓度为2μg/ml。
二、cell-in-cell形成实验
具体步骤同实施例1步骤二，除了细胞悬浮时间为6h。上皮细胞mcf10a或肿瘤细胞mcf7中重新表达cdkn2a可显著抑制cell-in-cell结构形成(图4)。
<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120>一种靶向cdkn2a的cic细胞模型及其制备方法
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