用于检测SLCO1B1521T>C基因多态性的引物对、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，尤其涉及一种用于检测slco1b1521t>c基因多态性的引物对、探针及试剂盒。
背景技术：
聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术。荧光pcr(qpcr)检测，是在pcr技术基础发展的实时检测技术，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析或根据荧光信号累积检测目标基因。该技术实现了pcr从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，它具有特异性更强、有效解决pcr污染问题、自动化程度高等特点，到21世纪初已得到广泛应用。pcr检测方法虽然具有快速特点，但是其快速是相对于其他检查，如培养，目前国内外门诊检测越来越需要更快出结果，而目前的pcr技术每个循环需要加热冷却，达到快速pcr目的的方法主要集中在缩短加热冷却时间，缩短时间效果有限，由于传统引物探针设计依靠序列特异性，需要一定范围的tm值，导致pcr反应本身需要每个循环75秒左右时间，为了缩短检测时间，只能减少循环数，导致快速pcr灵敏度降低。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性,snps作为第三代遗传标记，具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定,snps还影响机体的生理特征、药物代谢能力、病理条件,常用于研究或诊断疾病的易感性、个性化医疗；比如由slco1b1基因编码的有机阴离子转运多肽1b1(oatp1b1，又称oatp-c、oatp2或lst1)，在肝细胞摄取和清除内源性和外源性物质如：他汀类药物、甲状腺素、非结合型胆红素、胆汁酸、瑞格列奈、依那普利拉、替莫普利、奥美沙坦、缬沙坦、甲氨蝶呤和伊立替康活性代谢产物sn-38等中发挥重要作用。slco1b1基因第5外显子521t>c(rs4149056，val174ala)多态性是黄色人种的主要遗传变异，等位基因频率10～15％，携带slco1b1521c纯合子会显著降低其对底物的摄取能力，使普伐他汀、阿托伐他汀和罗苏伐他汀等他汀类药物的血药浓度上升，从而可能导致肝功能下降和横纹肌溶解症等严重不良反应。为降低他汀类药物严重不良反应的发生风险，《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中建议“临床上根据slco1b1基因型选择他汀类药物进行治疗。”现阶段用来检测slco1b1基因521t>c位点的方法主要有：1)pcr-sscp法；2)异源双链分析法(ha)；3)突变体富集pcr法(mutant-enrichedpcr)；4)等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specificoligonucleotide,aso)；5)dna芯片技术(dnachip)；6)突变扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,arms)；7)焦磷酸测序法等方法。上述方法中pcr-sscp法、异源双链分析法、突变体富集pcr法等需要第一步pcr反应结束后开启试管盖，容易导致反应产物污染空气，形成气溶胶，导致假阳性结果；而测序法需要配置昂贵的测试仪，测试试剂价格昂贵，难以普及，同时测序法依靠波峰的重叠和高度进行判断，导致在高拷贝野生型信号背景中不易检测出低拷贝突变；芯片法需要进行前pcr扩增，容易产生气溶胶污染，检出原理为突变探针和野生型探针荧光值对比计算，和测序法同样具有在高拷贝野生型信号背景中不易检测出低拷贝突变的问题；arms-pcr方法古典方法是设计两套反应体系，依靠两个法宁体系中的ct值差异进行判断，反应体系需要反复优化，同时需要两个反应试管，或者需要设计蝎型引物，环形区域和线形区域需要使用昂贵的空间子修饰，同时设计繁杂，需要验证多个序列的引物探针，导致研发可行性降低，检测成本上升；同时传统方法引物和探针长度比较长，需要更长的退火(annealing)和延伸(extension)时间，导致检测时间长，这些技术的缺陷和设计难度影响临床使用范围和临床推广，亟需一种新的pcr检测方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测slco1b1521t>c基因多态性的引物对、探针及试剂盒，从而解决现有技术中slco1b1521t>c基因多态性检测耗时长、非特异性扩增明显等问题。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：第一方面，本发明提供一种用于检测slco1b1521t>c基因多态性的引物对，包括有：针对slco1b1521位点设计的碱基序列如seqidno.1、seqidno.2所示的引物；其中，所述碱基序列的5’端碱基具有氨基修饰基团。第二方面，本发明提供一种用于检测slco1b1521t>c基因多态性的引物对的制备方法，包括如下步骤：针对slco1b1521位点设计碱基序列如seqidno.1、seqidno.2所示的引物，并用氨基基团对所述碱基序列的5’端碱基进行修饰。第三方面，本发明提供一种用于检测slco1b1521t>c基因多态性的探针，包括有：针对slco1b1521位点设计的碱基序列如seqidno.3、seqidno.4所示的荧光探针；其中，所述碱基序列中的一个碱基具有氨基修饰基团。在其中一个实施例中，所述碱基序列如seqidno.3的荧光探针，其5’端开始第三个碱基具有氨基修饰基团；所述碱基序列如seqidno.4的荧光探针，其5’端开始第六个碱基具有氨基修饰基团。第四方面，本发明提供一种用于检测slco1b1521t>c基因多态性的探针的制备方法，包括针对slco1b1521位点设计碱基序列如seqidno.3、seqidno.4所示的荧光探针，并用氨基基团修饰所述碱基序列中的一个碱基。在其中一个实施例中，所述修饰的位点包括：seqidno.3所示碱基序列的5’端开始第三个碱基和/或seqidno.4所示碱基序列的5’端开始第六个碱基。第五方面，本发明提供一种用于检测slco1b1521t>c基因多态性的试剂盒，包括有：针对slco1b1521位点设计的碱基序列如seqidno.1、seqidno.2所示的引物；其中，所述碱基序列的5’端碱基具有氨基修饰基团；针对slco1b1521位点设计的碱基序列如seqidno.3、seqidno.4所示的荧光探针；其中，所述碱基序列中的一个碱基具有氨基修饰基团。在其中一个实施例中，所述碱基序列如seqidno.3的荧光探针，其5’端开始第三个碱基具有氨基修饰基团；所述碱基序列如seqidno.4的荧光探针，其5’端开始第六个碱基具有氨基修饰基团。第六方面，本发明提供一种检测slco1b1521t>c基因多态性的荧光pcr方法，包括引物对、荧光探针选择、配制pcr反应体系、设置反应条件的步骤，其中，所述引物对采用上述的引物对，所述荧光探针采用上述的荧光探针。在其中一个实施例中，所述设置反应条件的步骤中，反应温度设为60-63.2℃。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明试剂盒，针对slco1b1基因521位点设计20bp以下的特别是15-20bp的引物序列以及20bp以下的特别是15-20bp的探针序列，经过大量实验从众多的引物序列、探针序列中筛选出了高特异性的序列作为引物对、探针，并且采用氨基基团修饰筛选出的引物对和探针，显著缩短检测所需时间，减少非特异性扩增，降低引物、探针设计难度和检测成本,不影响诊断精度，实现单一反应管闭盖即可同时检测slco1b1基因521位点c/c、c/t、t/t基因型，最大限度的避免气溶胶污染，方便临床使用，减少操作导致的误差。本发明的引物，采用氨基基团修饰长度为20bp以下的特别是15-20bp引物的5’端，以提高引物tm值达到60℃左右，所扩增片段长度短于60bp的情况下能够实现特异性检测、高精度检测，且缩短检测时间。本发明的荧光探针，使用氨基基团修饰长度为20bp以下的特别是15-20bp探针的一个碱基，以提高探针tm值达到68-70℃，这种设计保证了探针在60℃退火延伸时探针的杂交效率很低，再加上等位基因有两条探针，反应中一直保证100％同序列的探针先于另外一条具有一个碱基的探针杂交到模板，竞争性抑制非100％同序列的探针的杂交，最终达到特异性检测snps的目的。本发明的检测方法，基于对引物对、探针的上述限定，与现有检测方法相比，变性时间仅需2-10s，退火延伸时间仅需2-30s，整个检测流程缩短了20-35min；进一步地，反应时间的缩短还进一步缩短了非100％相同序列探针杂交时间，使得效率低下的错配探针杂交的杂交量更降低，最终达到特异性检测点突变的目的。附图说明图1为温度梯度pcr程序图：仪器为biorad公司cfx核酸扩增pcr仪器；图2为检测用pcr扩增程序图：仪器为lifetech(appliedbiosystems)abi7500核酸扩增仪器；图3为检测用pcr扩增程序图：biorad公司cfx核酸扩增pcr仪器。具体实施方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1、用于检测slco1b1521t>c基因多态性的引物对及其制备方法本实施例针对slco1b1521位点设计了引物对。根据rs4149056序列(seqidno.5)设计引物对，引物对序列如下：正向引物(seqidno.1)：5’(氨基基团)-ggtcatacatgtggat3’；反向引物(seqidno.2)：5’(氨基基团)-tctcccctattccac3’。本实施例中，引物的制备包括：针对slco1b1521位点设计碱基序列如seqidno.1、seqidno.2所示的引物，并用氨基基团对所述碱基序列的5’端碱基进行修饰，即得。制备上述引物对的过程中，采用abi公司引物设计软件primerexpress分别对氨基基团修饰前的碱基序列、氨基基团修饰后的碱基序列的tm值进行测试，结果如下：修饰前：正向引物碱基序列的tm值为37.9℃，反向引物碱基序列的tm值为40.8℃；修饰后：正向引物碱基序列的tm值为58.2℃，反向引物碱基序列的tm值为59.7℃；修饰前碱基序列的tm值均比常规荧光pcr引物温度低,经过5’端第一碱基氨基基团修饰后的tm值显著提升。本发明用于检测slco1b1521t>c基因多态性的引物对委托广州艾基生物科技有限公司合成。实施例2、用于检测slco1b1521t>c基因多态性的探针及其制备方法本实施例针对slco1b1521位点设计了荧光探针。根据rs4149056序列(seqidno.5)突变片断设计野生型探针和突变型探针：野生型探针(seqidno.3)：5’fam-tat(氨基基团)g-t-gttcatgggtaatatgc-bhq13’，5’端开始第三个碱基(t)使用氨基基团修饰,5’端开始第五个碱基t为snp位点，为野生型。突变型探针(seqidno.4)：5’cy5-fam-tatg-c-g(氨基基团)ttcatgggtaatatgc-bhq23’；5’端开始第六个碱基(g)使用氨基基团修饰,5’端开始第五个碱基c为snp位点，为变异型。上述荧光探针的制备包括：针对slco1b1521位点设计碱基序列如seqidno.3、seqidno.4所示的荧光探针，并用氨基基团修饰所述碱基序列中的一个碱基，即得。制备上述探针过程中，采用abi公司引物设计软件primerexpress分别对氨基基团修饰前的碱基序列、氨基基团修饰后的碱基序列的tm值进行测试，结果如下：修饰前：野生型探针碱基序列的tm值为51.5℃，突变型探针碱基序列的tm值为56.3℃；修饰后：野生型探针碱基序列的tm值为69.2℃，突变型探针碱基序列的tm值为71.6℃。本发明用于检测slco1b1521t>c基因多态性的探针委托广州艾基生物科技有限公司合成。实施例3、用于检测slco1b1521t>c基因多态性的试剂盒本实施例针对slco1b1521位点设计了含有实施例1引物对和实施例2探针的试剂盒。实施例4、构建质粒构建slco1b1基因521位点snps野生型和突变型质粒：检索ncbi-dbsnps，找到rs4149056序列(参见seqidno.6)，委托上海瑞晶生物科技有限公司构建野生型质粒和突变型质粒，野生型质粒序列如seqidno.6所示，突变型质粒序列如seqidno.7所示。实施例5、用于检测slco1b1521t>c基因多态性的试剂盒的反应温度优化为了验证引物、探针及寻找最佳反应温度，进行温度梯度pcr测试，使用伯乐(biorad)cfx荧光pcr仪进行温度梯度荧光pcr。1、反应体系如下：最终反应体系25ul。按照比例配制48反应所需的反应液，分注48个pcr用200ul白色离心管，再加入dna模板。其中，dna模板(wt为野生型质粒、mt为突变型质粒)参见如下表1：表1温度010203040506a68.0℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照b67.6℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照c66.7℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照d65.1℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照e63.2℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照f61.6℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照g60.6℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照h60.0℃wt-107wt-105wt-104wt-103mt-107空白对照2、反应程序如图1。95度3分钟-1个循环95度2秒，60～68度温度梯度30秒-45循环3、反应结果反应结果请参见表2，从表2可看出：在60-63.2℃可以检测出野生型模板，而突变型模板未见荧光，最佳温度为60℃，所有温度均未检测出突变型模板，由此大致确定反应温度和条件。表2实施例6、采用实施例3提供的试剂盒进行野生型模板和突变型模板检测1、abi7500荧光pcr扩增仪(1)反应体系如下：其中，dna模板(wt为野生型质粒、mt为突变型质粒)见表3：表378910amt-103mt-107wt-103wt-107bmt-103mt-107wt-103wt-107cmt-103mt-107wt-103wt-107dmt-103mt-107wt-103wt-107emt-103mt-107wt-103wt-107fmt-103mt-107wt-103wt-107gmt-103mt-107wt-103wt-107h空白空白空白空白(2)反应程序如图2，45个循环总耗时67分钟。95度5分钟-1个循环95度10秒，60度30秒-45个循环(3)反应结果烦请结果请参见表4，从表4可见：本发明方法可以有效检测高拷贝数和低拷贝数的野生型和突变型slco1b1质粒，而且没有检测到非特异性信号。表4采用abi7500荧光pcr扩增仪时，变性温度为95℃、变性时间为10秒，退火延伸温度为60℃、退火延伸时间为30秒，每个循环比常规pcr(变性时间15秒、退火延伸时间60秒)缩短反应时间35秒，进行35-45个循环，总时间至少缩短20分钟。2、bio-radcfx96touch实时荧光pcr扩增仪器(1)反应体系如下：其中，dna模板(wt为野生型、mt为突变性质粒)见表5：表578910amt-103mt-107wt-103wt-107bmt-103mt-107wt-103wt-107cmt-103mt-107wt-103wt-107dmt-103mt-107wt-103wt-107emt-103mt-107wt-103wt-107fmt-103mt-107wt-103wt-107gmt-103mt-107wt-103wt-107h空白空白空白空白(2)反应程序如图3，50个循环总耗时45分钟。95度3分-1个循环95℃，2秒，60℃，10秒50循环(3)反应结果烦请结果见表6，从表6可见：本发明试剂盒在bio-rad的仪器上亦可以有效检测高拷贝数和低拷贝数的野生型和突变型slco1b1质粒，而且没有非特异性能信号。表6采用bio-radcfx96touch实时荧光pcr扩增仪时，变性温度为95℃、变性时间为2秒，退火延伸温度为60℃、退火延伸时间为10秒，每个循环缩短时间58秒，进行35-45个循环，总时间比常规pcr(变性时间15秒、退火延伸时间60秒)至少缩短35分钟。本发明上述实施例中，结果判读依据为：slco1b1基因c677t野生型探针荧光报告集团为fam荧光基团、突变型探针报告基团为cy5荧光基团，野生型纯合子(t/t)只能检测出fam荧光、突变型纯合子(c/c)只能检测出cy5荧光，杂合型(c/t)可同时检测出fam荧光和cy5荧光。本发明上述实施例中，经测试，野生型探针和100％同序列的杂交温度和1个错配杂交温度相差17.1℃；变异型探针和100％同序列的杂交温度和1个错配杂交温度相差18.9℃。由此可计算出野生型探针和突变型模板杂交温度：tm-δt＝69.2-17.1＝52.1℃，比退火延伸温度60℃低7.9℃；突变型探针和野生型模板杂交温度tm-δt＝71.2-18.9＝52.3℃，比退火延伸温度60℃低7.7℃。本发明的上述实施例，利用非常规的taqman探针设计和引物设计方法以及时间限制pcr方法，快速方便有效而低成本检测snps，该检测方法实现在单个pcr反应管同时检测slco1b1基因521位点c/c、c/t、t/t基因型，方便临床操作，减少气溶胶污染，最大限度的避免假阳性和假阴性。该方法针对诊断目的灵活应用，同时可用于其它用途：科研、基因分析等。本发明上述实施例，采用氨基基团修饰的引物、探针，且长度均在20bp以下，扩增产物总长度小于60bp，由此减少扩增所需时间，实现快速pcr目的，探针tm温度约为70℃左右，而错配一个碱基后的tm值低于退火延伸温度，这种设计保证了探针在60℃退火延伸时探针的杂交效率很低，再加上等位基因有两条探针，反应中一直保证100％同序列的探针优先于另外一条具有一个碱基的探针杂交到模板，竞争性抑制非100％同序列的探针的杂交，最终达到特异性检测snps的目的，而时间限制pcr程序人为缩短非100％相同序列探针杂交时间，使得效率低下的错配探针杂交的杂交量更降低，最终达到特异性检测点突变的目的。对比例本对比例是实施例6第1部分(即采用abi7500荧光pcr扩增仪的部分)的对比例，为了验证不同位点碱基修饰的效果，设计了同seqidno1、seqidno2、seqidno3、seqidno3序列相同，修饰位点不同的多组引物和探针，进行对比，发现只有一组能检测出荧光，对比之处仅在于试剂盒的引物和探针中氨基基团修饰位点不同，具体如下：对比组正向引物(seqidno.8)：5’gg-(氨基基团)-tcatacatgtggat3’；对比组反向引物(seqidno.9)：5’tct-(氨基基团)-cccctattccac3’。对比组野生型探针(seqidno.10)：5’fam-ta(氨基基团)tg-t-gttcatgggtaatatgc-bhq13’，5’端开始第二个碱基(a)使用氨基基团修饰,5’端开始第五个碱基为snp位点。对比组突变型探针(seqidno.11)：5’cy5-tat(氨基基团)g-c-gttcatgggtaatatgc-bhq23’；缓冲液以及反应体系与实验组相同，反应程序使用同等条件。检测结果：1、abi7500荧光pcr扩增仪(1)反应体系如下：其中，dna模板(wt为野生型质粒、mt为突变型质粒)见表7：表7(2)反应程序如图2，45个循环总耗时67分钟。95度5分钟-1个循环95度10秒，60度30秒-45个循环(3)反应结果烦请结果请参见表8，从表8可见：本发明方法(阳性对照)测高拷贝数和低拷贝数的野生型和突变型slco1b1质粒均能检测出荧光信号，而改变氨基修饰位置的引物探针检测高拷贝数模版ct值右移9～13左右，低拷贝数模版未能检测出荧光信号，表明灵敏度降低。表8本发明的基因检测方法也适用于非点突变基因检测，此时反应时间范围和温度更广，变性温度范围90-96℃，变性反应时间范围2-15秒或更长，退火延伸反应温度范围在51-65℃，时间约2-60秒或更长。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>东莞博盛生物科技有限公司<120>用于检测slco1b1521t>c基因多态性的引物对、探针及试剂盒<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>artificialsequence<400>1ggtcatacatgtggat16<210>2<211>15<212>dna<213>artificialsequence<400>2tctcccctattccac15<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>3tatgtgttcatgggtaatatgc22<210>4<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>4tatgcgttcatgggtaatatgc22<210>5<211>1001<212>dna<213>homosapiens<400>5taatctccacatgccaagagtggggccaggtagagataattgaattttgggggcggtttc60ccccatactgttctcgtggtaatgaagaagtctcacaagatctgatgattttataaatga120gagttcccctgcaaaagctctcttgcctgccaccatgtaagacatggctttgctcttcct180tcatcttccgccatgattgtgaggccccccagccatgaggaactatgagtccattagacc240cttttcctttataaattacccagtctcaggtatgtatttattagcagcataagaatggac300taatacaccatattgtcaaagtttgcaaagtgaatataaattacttgtacttgtaaatta360aaaaaaaataagtagaataattaagagtttacaagtagttaaatttgtaatagaaatgct420aaaattaatgtttaaaatgaaacactctcttatctacataggttgtttaaaggaatctgg480gtcatacatgtggatatatgygttcatgggtaatatgcttcgtggaataggggagactcc540catagtaccattggggctttcttacattgatgatttcgctaaagaaggacattcttcttt600gtatttaggtaatgtacacaaaatattaaattgtatgatcactttccctttgtctacttt660tgaaatagtagagttactaaacttattattttacctattagaacatatatttgggtatat720gtattgtatcatatttcttttaaaaacatggtgaataagaaccatgcattcttggcatct780agtaaaattgctttataatattttcaggtatattgaatgcaatagcaatgattggtccaa840tcattggctttaccctgggatctctgttttctaaaatgtacgtggatattggatatgtag900atctaagtaagtacaaccagaacaaggtaccatgataacgtctttctaagcacacatgcg960aaaaacattttttcaaataactgaattcactctttcaatag1001<210>6<211>2988<212>dna<213>artificialsequence<400>6tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgc180accatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgcc240attcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctat300tacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggt360tttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattagaactcggtacgcgcggat420cttccagagattaagtagttaaatttgtaatagaaatgctaaaattaatgtttaaaatga480aacactctcttatctacataggttgtttaaaggaatctgggtcatacatgtggatatatg540tgttcatgggtaatatgcttcgtggaataggggagactcccatagtaccattggggcttt600cttacattgatgatttcgctaaagaaggacattcttctttgtatttaggtaatgtacaca660aaatattaaattgtatgatcactttccctttgtctacttttgaaatagtagagttactaa720acttataatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaatcatggtcatagctgtttc780ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagt840gtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgc900ccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgg960ggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgct1020cggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatcca1080cagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagga1140accgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatc1200acaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccagg1260cgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggat1320acctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggt1380atctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttc1440agcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacg1500acttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcg1560gtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttg1620gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccg1680gcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgca1740gaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgga1800acgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctaga1860tccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggt1920ctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgtt1980catccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccat2040ctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcag2100caataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcct2160ccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtt2220tgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg2280cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgca2340aaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgt2400tatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagat2460gcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgac2520cgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaa2580aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgt2640tgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactt2700tcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataa2760gggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcattt2820atcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaa2880taggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattatta2940tcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc2988<210>7<211>2988<212>dna<213>artificialsequence<400>7tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgc180accatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgcc240attcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcc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