一种KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及一种kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测方法及检测试剂盒。

背景技术

kras、nras、pik3ca、braf都是egfr下游的信号分子，是众多信号通路上关键的激活因子。这些基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在结直肠癌患者中的突变率分别为20～50％、1～6％、10～30％、8～15％。kras、nras、pik3ca、braf基因突变一般会使结直肠癌患者对抗egfr抗体类药物产生耐药。

但现在因缺乏精准、高效的kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测手段，进而阻碍了病人治疗用药及临床研究。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测方法和检测试剂盒。

一种kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测方法，包括以下步骤：提取样本dna；设计用于扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段的特异性引物；利用单管多重pcr扩增反应得到目标片段；设计用于kras/nras/pik3ca/braf基因片段的单碱基延伸引物；kras/nras/pik3ca/braf基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量目标dna序列。

进一步地，所述kras/nras/pik3ca/braf基因片段包括kras-1片段、nras-2片段、pik3ca-3片段及braf-4片段。

进一步地，所述用于扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段的特异性引物包括：用于扩增kras-1片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：1或2，反向引物为seqidnos：3或4；用于扩增nras-2片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：5或6，反向引物为seqidnos：7或8；用于扩增pik3ca-3片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：9或10，反向引物为seqidnos：11或12；用于扩增braf-4片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：13或14，反向引物为seqidnos：15或16。

进一步地，所述用于kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合片段的单碱基延伸引物包括：用于kras-1片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：61；用于nras-2片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：62；用于pik3ca-3片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：63；用于braf-4片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：64。

进一步地，所述利用单管多重pcr扩增反应包括以下步骤：taq酶激活，dna变性。

进一步地，taq酶激活时温度为95℃。

进一步地，taq酶激活时间为15分钟。

进一步地，dna变性时温度为95℃。

进一步地，dna变性时间为15秒。

一种kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测试剂盒，包括：用于扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段的特异性引物，特异性引物包括seqidnos：1或2、seqidnos：3或4、seqidnos：5或6、seqidnos：7或8、seqidnos：9或10、seqidnos：11或12、seqidnos：13或14、seqidnos：15或16；用于kras/nras/pik3ca/braf基因片段的单碱基延伸引物，单碱基延伸引物包括seqidnos：61、seqidnos：62、seqidnos：63、seqidnos：64。

相比现有技术，本发明通过设计特异性引物扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段，设计单碱基延伸引物使kras/nras/pik3ca/braf融合基因片段的单碱基延伸，再通过核酸质谱分析测量目标dna序列，能够有效地对非小细胞肺癌患者展开kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测筛查，为此类患者开展个性化精准诊治奠定临床及科研基础。通过精准的、高通量的质谱技术，对kras/nras/pik3ca/braf基因突变的联合检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的结直肠癌等癌症患者。

附图说明

图1为本发明一种kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，当组件被称为“固定于”另一个组件，它可以直接在另一个组件上或者也可以存在居中的组件。当一个组件被认为是“连接”另一个组件，它可以是直接连接到另一个组件或者可能同时存在居中组件。当一个组件被认为是“设置于”另一个组件，它可以是直接设置在另一个组件上或者可能同时存在居中组件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请参阅图1，本发明涉及一种kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测方法，包括以下步骤：提取样本dna；设计用于扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段的特异性引物；利用单管多重pcr扩增反应得到目标片段；设计用于kras/nras/pik3ca/braf基因片段的单碱基延伸引物；kras/nras/pik3ca/braf基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量目标dna序列。

kras/nras/pik3ca/braf基因片段包括kras-1片段、nras-2片段、pik3ca-3片段及braf-4片段。

用于扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段的特异性引物包括：用于扩增kras-1片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：1或2，反向引物为seqidnos：3或4；用于扩增nras-2片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：5或6，反向引物为seqidnos：7或8；用于扩增pik3ca-3片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：9或10，反向引物为seqidnos：11或12；用于扩增braf-4片段的特异性引物，正向引物为：seqidnos：13或14，反向引物为seqidnos：15或16。

kras-1基因的正向引物seqidnos：1的序列为：ttgaacgtgtgattggcagaaac，

kras-1基因的正向引物seqidnos：2的序列为：ggaatgagatagtttctg，

kras-1基因的反向引物seqidnos：3的序列为：tctccctcatgacgctgcggaa，

kras-1基因的反向引物seqidnos：4的序列为：atatggagtagggtcacccaccc，

nras-2基因的正向引物seqidnos：5的序列为：tgatgggcacttggattactttcac，

nras-2基因的正向引物seqidnos：6的序列为：taaccaggcgtggtgggttcttc，

nras-2基因的反向引物seqidnos：7的序列为：caatggacatgaacaaccct，

nras-2基因的反向引物seqidnos：8的序列为：actgattgaccagttaaacatc，

pik3ca-3基因的正向引物seqidnos：9的序列为：gccattgcccagggagggaaagtt，

pik3ca-3基因的正向引物seqidnos：10的序列为：taccacccttcccagcaggct，

pik3ca-3基因的反向引物seqidnos：11的序列为：agactcctgttagttacctcccca，

pik3ca-3基因的反向引物seqidnos：12的序列为：tgccaggagatcatcga,

braf-4基因的正向引物seqidnos：13的序列为：gtggtgcacgaggtccagagatac，

braf-4基因的正向引物seqidnos：14的序列为：acgaggtccagagatacattga，

braf-4基因的反向引物seqidnos：15的序列为：gaagaggagcattgagga，

braf-4基因的反向引物seqidnos：16的序列为：aggaccgtgttcaagaggaagccc。

用于kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合片段的单碱基延伸引物包括：用于kras-1片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：61；用于nras-2片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：62；用于pik3ca-3片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：63；用于braf-4片段的单碱基延伸引物，序列为seqidnos：64。

kras-1基因的单碱基延伸引物seqidnos：61的序列为：acgttggatgtcttcatgaagacctcacag，

nras-2基因的单碱基延伸引物seqidnos：62的序列为：acgttggatgccactaaatcgagatttcac，

pik3ca-3基因的单碱基延伸引物seqidnos：63的序列为：acgttggatgttgtccccaggaagcatacg。

braf-4基因的单碱基延伸引物seqidnos：63的序列为：acgttggatgagaaggcgggagacatatgg。

利用单管多重pcr扩增反应包括以下步骤：taq酶激活，dna变性。taq酶激活时温度为95℃。taq酶激活时间为15分钟。dna变性时温度为95℃。dna变性时间为15秒。

下表为kras/nras/pik3ca/braf基因引物序列表

本发明还涉及一种kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测试剂盒，包括：用于扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段的特异性引物，特异性引物包括seqidnos：1或2、seqidnos：3或4、seqidnos：5或6、seqidnos：7或8、seqidnos：9或10、seqidnos：11或12、seqidnos：13或14、seqidnos：15或16；用于kras/nras/pik3ca/braf基因片段的单碱基延伸引物，单碱基延伸引物包括seqidnos：61、seqidnos：62、seqidnos：63、seqidnos：64。

本发明通过设计特异性引物扩增kras/nras/pik3ca/braf基因片段，设计单碱基延伸引物使kras/nras/pik3ca/braf融合基因片段的单碱基延伸，再通过核酸质谱分析测量目标dna序列，能够有效地对非小细胞肺癌患者展开kras/nras/pik3ca/braf基因突变联合检测筛查，为此类患者开展个性化精准诊治奠定临床及科研基础。通过精准的、高通量的质谱技术，对kras/nras/pik3ca/braf基因突变的联合检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的结直肠癌等癌症患者。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。