本发明涉及茶叶中的有效成分的提取制备方法，具体涉及一种从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法，属于化合物制备技术领域。
背景技术
茶树是多年生常绿叶用作物。在茶的鲜叶中，水分约占75％，干物质为25％左右。到目前为止，茶叶中经分离、鉴定的已知化合物有1400多种，其中茶多酚、氨基酸、生物碱是影响茶叶品质的三类重要物质。茶多酚类亦称“茶鞣质”、“茶单宁”，是一类存在于茶树中的多元酚的混合物，主要包括儿茶素类、黄酮及黄酮醇类、花青素及花白素类和酚酸及缩酚酸类。其中，黄酮及黄酮醇类是一类广泛存在自然界的黄色色素，在干茶中的含量约为3-4％，带苦涩味，对绿茶汤色的影响较大。
自从20世纪50年代nakabayashi等人首次在茶叶中发现了黄酮及其苷类物质，针对茶叶中黄酮类物质的研究就此展开。早期，茶叶中黄酮类化合物的分离主要使用纸层析(pc)、薄层层析(tlc)等手段。液相色谱、质谱、光电二极管阵列检测、核磁共振等检测技术的发展和在茶叶领域的应用使茶叶黄酮分离、检测的同时进行成为了一种可能。随后，超高效液相色谱的应用使茶叶中黄酮类物质的分离迈上了更快、更好的新台阶。但是由于茶叶中黄酮类物质的含量以及分离手段的局限性，目前尚未得到茶叶中全部黄酮醇苷类物质的标准品，这对茶叶中黄酮类物质的进一步研究造成了一定的困难。
槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷，即，槲皮素-3-o-[β-葡萄糖-(1→3)-α-鼠李糖-(1→6)-β葡萄糖]，在已经公开的《flavonolglycosidesintea-kaempferolandquercetinrhamnodiglucosides》中有明确告知。
槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷，目前现有的制备方法为：称取20g茶叶用纯甲醇以1:50茶水比浸提一次(15min,40℃)，70％甲醇溶液以1：20茶水比浸提两次。上清液蒸发浓缩至100ml，并用去离子水定容到200ml。将茶汤用聚酰胺柱(20cm×3cmid)层析进行预处理。聚酰胺事先用纯甲醇溶胀，并用500ml去离子水冲洗。茶汤上样50ml，首先用250ml去离子水洗去糖类和矿物质，弃去洗脱液；再用500ml纯甲醇洗脱黄酮醇苷，将洗脱液浓缩至近足干，转移后用水定容至10ml。使用nucleosilc185um的制备色谱柱，采用0.2％乙酸(a相)和纯乙腈(b相)作为流动相，洗脱方法如下：(1)a:b＝85:15,12ml/min；(2)a:b＝87:13,16ml/min；(3)a:b＝82:18,12ml/min，收集对应时间产物，真空冻干得到黄酮醇苷纯品粉末。
上述方法需要使用制备色谱进行3次分离后才能得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷纯品，耗时长；不利于大量制备。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法，包括以下步骤：
(1)、将茶叶加水浸提，过滤，得茶叶提取液；
(2)、将茶叶提取液进行聚酰胺柱色谱分离，得到粗产品溶液；
将茶叶提取液上样后进行梯度洗脱(即，茶叶提取液被填料吸附完成后进行梯度洗脱)，聚酰胺柱填料与茶叶提取液的上样量的固液比为1g/1.9～2.1ml(较佳为1g/2ml)；
梯度洗脱条件为：水(4～8bv)→15％甲醇水溶液(4～8bv)→粗品提取溶剂(12-20bv)→甲醇(纯甲醇，4～12bv)；
上述4种洗涤剂的流速均为62～66bv/h(较佳为64bv/h)；
粗品提取溶剂为30％～50％(体积％)甲醇水溶液；
分别各自收集每种洗脱剂对应的洗脱液，粗品提取溶剂洗脱收集得到的洗脱液经浓缩后即得到粗产品溶液；
备注说明：bv为一个柱体积，柱体积指的是层析柱中填料的体积；聚酰胺溶胀后，单位体积约为3.85ml/g；
(3)、将粗产品溶液进行制备色谱分离，收集组分，得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷溶液；
(4)将步骤(3)中所得到的溶液经减压浓缩，冷冻干燥(-40～-60℃的温度下干燥至含水率≤5％)，得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷(作为目标单体)。
作为本发明的从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法的改进：步骤(3)的色谱分离条件如下：流动相a为3％乙腈+5‰乙酸，流动相b为30％乙腈+5‰乙酸；ymc-packods-a色谱柱；进样量500ul；洗脱流速2ml/min；洗脱梯度：45％b，0min；45％b，35min；65％b，55min；收集目标物的组分(即，收集约第46分钟的组分为目标物)。
作为本发明的从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法的进一步改进：所述步骤(2)中：聚酰胺作为填料装于层析柱(玻璃层析柱规格为内径:高＝1：3～10)内，填料量为柱体积的1/6～2/3。
作为本发明的从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法的进一步改进，所述步骤(2)中：
当以水、15％甲醇水溶液、纯甲醇作为洗脱剂时，所得的洗脱液旋转蒸发蒸干，所收集的馏分可重复使用(即，可以用作于下次实验的洗脱剂)。
作为本发明的从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法的进一步改进，所述步骤(2)中：
将粗品提取溶剂对应得到的洗脱液浓缩至有固体(黄色固体)析出，将该固体用少量纯净水溶解(纯净水的量只需能使该固体溶解即可)，得粗产品溶液。
作为本发明的从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法的进一步改进：所述步骤(1)中：所述茶叶与水的料液比为1g/8～12ml(较佳为1g/10ml)，于90～100℃浸提(即，沸水浴浸提)20～40分钟。
本发明对茶叶中的化学成分进行提取、分离和制备，进一步确认和高纯度提取了一种化学成分——槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷，以期对茶叶中黄酮类物质的含量测定提供依据，同时探索出一种具有一定生产规模的制备方法。
与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：
(1)本发明利用聚酰胺层析柱对茶叶中各生物活性物质吸附的差异性，有效地分离了咖啡因，儿茶素等成分，获得了含有高比例目标产物的粗产品。此方法去除了茶叶中其他物质对目标产物的干扰，可以应用于大量目标产物的制备。
本发明结合制备色谱技术，从粗产品中大量制备高纯度的槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷，为茶叶中黄酮类物质的定量研究提供基础，有利于推动茶叶黄酮类物质检测分析标准方法的建立。
采用本发明方法制备而得的槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷，纯度≥99％。
(2)本发明成功纯化茶叶中的槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷，对其他茶叶黄酮的提纯有很大的借鉴意义。该黄酮单体的获得对研究黄酮类物质在绿茶茶汤中的呈色作用、黄酮类物质的人体保健功能等多方面具有广泛的应用价值。
(3)本发明中涉及的提取方法简单，分离操作较为方便，使用的试剂无毒无害，聚酰胺柱及部分试剂可以回收利用，对环境友好；同时，本发明使用低档茶作为制备原料，进一步拓宽中低档茶叶的应用领域，有助于提高茶叶的实际应用价值，推动整个茶产业的提质增效。
(4)本发明使用聚酰胺柱层析进行预处理后，仅需进行一次制备色谱柱分离即可得到纯品，实验效率较高。同时粗提物中目标产物比例高，可进行大量制备。
综上所述，本发明从茶叶中制备得到一种明确的化合物——槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷，其提取方法简单，分离操作较为方便，采用聚酰胺柱层析方法和液相制备色谱相结合的方法，首次从茶叶中大量分离纯化得到该化合物，为茶叶中黄酮类物质的定量研究提供基础，有利于推动茶叶黄酮类物质检测分析标准方法的建立。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为实施例1中制备得到的化合物的分子结构式；
图2为实施例1中制备得到的化合物的质谱；
图3为实施例1中制备得到的化合物的h谱；
图4为实施例1中制备得到的化合物的c谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中出现的百分数％，如无特殊说明表示的是体积百分数，溶剂为水，例如：
“50％甲醇水溶液”表示甲醇的水溶液，其中甲醇的体积百分数为50％；
“3％乙腈+5‰乙酸”表示为水与乙腈、乙酸的混合溶液，该混合溶液中乙腈的体积百分数为3％，乙酸的体积百分数为5‰，余量为水；
“30％乙腈+5‰乙酸”表示为水与乙腈、乙酸的混合溶液，该混合溶液中乙腈的体积百分数为30％，乙酸的体积百分数为5‰，余量为水。
实施例1、一种从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法，包括以下步骤：
(1)、称取磨碎(过20目的筛)的茶叶10g，按1g:10ml的料液比，用热水在100℃水浴中浸提30min。浸提完成后，过滤，所得的滤液即为茶叶提取液。
(2)、将茶叶提取液进行聚酰胺柱色谱分离，得到粗产品溶液；具体为依次进行以下步骤：
称取聚酰胺(100目～200目)5g，填于3.5cm*11cm的层析柱中，活化待用。所述活化具体为：使用纯甲醇溶胀后，湿法装柱，用足量的去离子水洗至洗脱液无醇味；使用2％naoh溶液将洗脱液洗至为碱性后，使用去离子水将洗脱液洗至为中性，再使用4％hcl溶液将洗脱液洗为至酸性后，使用去离子水将洗脱液洗至为中性即完成柱子的活化，待用。
过聚酰胺柱时，按填料量：上样量＝1g:2ml的固液比将茶叶提取液上样(即，茶叶提取液的用量为10ml)。待层析表面上茶汤完全被聚酰胺吸附，液体变为无色，上样完成。开始梯度洗脱，先用80ml水洗去咖啡因等(流速为64bv/h)，再用80ml15％甲醇水溶液洗去杂质(流速为64bv/h)，再用240ml50％甲醇水溶液进行洗脱(流速为64bv/h)，最后用80ml纯甲醇洗净层析柱(流速为64bv/h)，洗净的层析柱可以重复使用。
多次上样(茶叶提取液被全部上样)，收集每次50％甲醇水溶液对应的洗脱液，通过减压(-11psi的压力)蒸馏进行浓缩直至蒸干，共析出黄色物质约150mg，用少量液体溶解黄色固体(以纯净水作为溶剂，溶剂的量只需能使黄色固体溶解即可)，得到黄酮醇苷粗提物溶液。蒸馏所得的馏分为50％甲醇水溶液，可回收重复利用。
上述水洗对应所得的洗脱液、15％甲醇水溶液洗涤对应所得的洗脱液、纯甲醇洗涤对应所得的洗脱液，均可各自旋转蒸发蒸干，所收集的馏分可重复使用，即，可以用作于下次实验的洗脱剂，从而减少制备成本。
(3)、将粗产品溶液(黄酮醇苷粗提物溶液)进行制备色谱分离，收集组分，得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷溶液；具体如下：
将步骤(2)所得的黄酮醇苷粗提物溶液利用ymc-packods-a色谱柱进行制备分离，条件如下：进样量500ul；流动相a为3％乙腈+5‰乙酸，流动相b为30％乙腈+5‰乙酸；洗脱流速2ml/min；洗脱梯度：45％b,0min；45％b,35min；65％b,55min。
按照上述的洗脱梯度和方法，对相同组分的洗脱液进行合并收集；收集第46分钟的组分为目标物。
(4)将步骤(3)中所得到的目标物溶液经减压浓缩(-11psi压力下浓缩至有固体析出)，冷冻干燥(-50℃的温度下干燥至含水率≤5％)，得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷粉末，约20mg。通过峰面积归一法测得，纯度在99％以上。
鉴定信息如下：
化合物中文名：槲皮素-3-o-[β-葡萄糖-(1→3)-α-鼠李糖-(1→6)-β葡萄糖]；化合物英文名：
quercetin-3-o-[β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-d-glucopyranoside]化合物的分子式为：c33h40o21,uvλmax＝203，255sh，354；lc-ms(esi-)，[m-h]-,771.1969。结构式如下。1hnmr(500mhz；cd3od)δ1.09[d,1h,h-c(6”’)],3.24[m,1h,h-c(5iv)],3.26[m,1h,h-c(2iv)],3.34[m,1h,h-c(5”)],3.41[m,5h,h-c(3”)h-c(4”)h-c(6”b)h-c(3iv)h-c(4iv)],3.47[m,1h,h-c(4”’)],3.50[dd,1h,h-c(5”’)],3.60[dd,1h,h-c(4”’)],3.71[dd,2h,h-c(6iv)],3.77[dd,1h,h-c(6”a)],3.93[dd,1h,h-c(2”’)],4.41[d,1h,h-c(1iv)],4.55[d,1h,h-c(1”)],5.08[d,1h,h-c(1”)],6.20[d,1h,h-c(6)],6.41[d,1h,h-c(8)],6.87[d,1h,h-c(5’)],7.62[dd,1h,h-c(6’)],7.62[dd,1h,h-c(2’)]；13cnmr(500mhz；cd3od)δ17.9(c-2”’),62.0(c-6iv),68.7(c-6”),69.3(c-5”’),70.8(c-4iv),71.2(c-2”’),71.3(c-4”’),72.5(c-4”),75.4(c-2iv),75.6(c-2”),77.0(c-3”),77.4(c-5iv,c-3iv),78.1(c-5”),83.0(c-3”’),94.9(c-8),99.9(c-6),102.3(c-1”’),104.8(c-10),105.6(c-1iv),116.0(c-5’),117.7(c-2’),123.0(c-1’),123.4(c-6’),135.6(c-3),145.7(c-3’),149.7(c-4’),158.5(c-9),159.3(c-2),162.9(c-5),166.0(c-7),179.3(c-4)。
其质谱、h谱、c谱分别如图2～图4所述。
实施例2、一种从茶叶中制备槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷的方法，包括以下步骤：
(1)、称取磨碎(过20目的筛)的茶叶5g，按1g:10ml的料液比，用热水在100℃水浴中浸提30min。浸提完成后，过滤，所得的滤液即为茶叶提取液。
(2)、将茶叶提取液进行聚酰胺柱色谱分离，得到粗产品溶液；具体为依次进行以下步骤：
称取聚酰胺(60目-100目)1.3g，填于1cm*9.5cm的层析柱中，活化步骤同实施例1。
过聚酰胺柱时，按填料量：上样量＝1g:2ml的固液比将茶叶提取液上样(即，茶叶提取液的用量为2.6ml)。待层析表面上茶汤完全被聚酰胺吸附，液体变为无色，上样完成。开始梯度洗脱，先用20ml水洗去咖啡因等(流速为64bv/h)，再用40ml15％甲醇水溶液洗去杂质(流速为64bv/h)，再用60ml30％甲醇水溶液进行洗脱(流速为64bv/h)，最后用20ml纯甲醇洗净层析柱(流速为64bv/h，洗净的层析柱可以重复使用)。
多次上样(茶叶提取液被全部上样)，收集30％甲醇水溶液对应的洗脱液，通过减压(-11psi的压力)蒸馏进行浓缩直至蒸干，共析出黄色物质约80mg，用少量液体溶解黄色固体(以纯净水作为溶剂，溶剂的量只需能使黄色固体溶解即可)，得到黄酮醇苷粗提物溶液。蒸馏所得的馏分为30％甲醇水溶液，可回收重复利用。
上述水洗对应所得的洗脱液、15％甲醇水溶液洗涤对应所得的洗脱液、纯甲醇洗涤对应所得的洗脱液，均可各自旋转蒸发蒸干，所收集的馏分可重复使用，即，可以用作于下次实验的洗脱剂，从而减少制备成本。
(3)、将粗产品溶液浓缩后进行制备色谱分离，收集组分，得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷溶液；具体如下：
将步骤(2)所得的黄酮醇苷粗提物溶液利用ymc-packods-a色谱柱进行制备分离，条件如下：进样量500ul；流动相a为3％乙腈+5‰乙酸，流动相b为30％乙腈+5‰乙酸；洗脱流速2ml/min；洗脱梯度：45％b,0min；45％b,35min；65％b,55min。
按照上述的洗脱梯度和方法，对相同组分的洗脱液进行合并收集，收集第46分钟的组分为目标物。
(4)将步骤(3)中所得到的目标物溶液经减压浓缩，冷冻干燥，得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷粉末，约10mg。通过峰面积归一法测得，纯度在99％以上。
物质鉴定如实施例1。
对比例1、去除实施例1步骤(2)中“用80ml15％甲醇水溶液洗去杂质”，其余等同于实施例1。
最终所得结果为：得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷粉末，约14mg。通过峰面积归一法测得，纯度≥95％。
对比例2-1、将步骤(3)中的流动相a改成“3％乙腈”，将流动相b改成“30％乙腈”；其余等同于实施例1。
最终所得结果为：得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷粉末，约17.5mg。通过峰面积归一法测得，纯度为90％。
对比例2-2、将步骤(3)中的流动相a改成“3％乙腈+1％乙酸”，将流动相b改成“30％乙腈+1％乙酸”；其余等同于实施例1。
最终所得结果为：得到槲皮素-3-o-葡萄糖鼠李糖葡萄糖苷粉末，约18.5mg。通过峰面积归一法测得，纯度为88％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。