本发明属于生物制药领域,涉及一种抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2及其制备方法。
背景技术:
蓖麻毒素(ricin)是来源于植物蓖麻种子中的一种高毒性糖蛋白,ricin对小鼠的腹腔半数致死剂量(ld50)约为3-8μg/kg,对成年人的致死剂量约为150μg,其毒性相当于氰化物毒性的6000倍左右。蓖麻毒素是具有两条肽链的高毒性的植物蛋白,该毒素易损伤肝、肾等实质器官,发生出血、变性、坏死病变。并能凝集和溶解红细胞,抑制麻痹心血管和呼吸中枢,是致死的主要原因之一。蓖麻毒素的来源容易、提取简单,易获得,难以监管,易造成社会危害,历史上曾有多次恐怖分子利用蓖麻毒素制造恐怖事件。1993年的化学武器公约将rt确定为一类化学品。其毒性取决于剂量、接触途径、摄入、肌肉注射或吸入能产生不同的毒性作用。rt的毒性作用具有明显的剂量依赖性,高剂量rt主要表现为抑制蛋白质合成,低剂量主要表现为诱导细胞因子的产生、诱发细胞凋亡。
20世纪70年代蓖麻毒素的一级结构测定已完成,由a、b两条链组成,两链间由一个二硫键连接。当毒素进入体内,a、b两条链分开。a链通过渗透经细胞膜进入细胞浆,主要使真核细胞的核糖体抑制失活,从而抑制蛋白质的合成。b链与细胞表面结合,通过内陷作用转入细胞内,它能促使a链进入胞浆。
根据人类历史与毒素斗争的经验,最有效而经济的手段之一是抗血清的被动免疫治疗,在某些重要毒素的治疗和预防上至今仍被使用,发挥重要的作用。抗血清(又名抗免疫球蛋白)自古以来是用于重要毒素的一种有效的应急措施,至今多种抗血清在临床广泛应用,发挥重要的治疗和预防毒素的作用。抗血清发展经历了传统的整个抗体分子,发展到今天有效去掉能引起毒副作用的fc段抗体分子和其它血浆杂蛋白分子,获得具有与毒素抗原特异结合的高纯度f(ab’)2治疗抗体,达到中和毒素的效果。
技术实现要素:
本发明一个目的是提供一种制备抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:用免疫原免疫动物,制备蓖麻毒素igg抗体,再将所述蓖麻毒素igg抗体去除fc段,得到抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2;
所述免疫原包括低毒或减毒的蓖麻毒素抗原。
上述方法中,所述低毒或减毒的蓖麻毒素抗原的ld50小于等于3.15μg/kg体重。
上述方法中,所述低毒或减毒的蓖麻毒素抗原为如下1)-3)中任一种:
1)、脱毒的天然蓖麻毒素;
2)、低毒或减毒蓖麻毒素突变体或其重组蛋白;
3)、编码所述低毒或减毒蓖麻毒素突变体或其重组蛋白的dna分子或表达所述dna分子的载体、表达盒、重组菌或重组病毒;
上述方法中,所述脱毒的天然蓖麻毒素的纯度大于等于90%;
或,所述低毒或减毒蓖麻毒素突变体为低毒或减毒的蓖麻毒素a链突变体;
或,所述低毒或减毒的蓖麻毒素a链突变体为定点突变修饰的低毒或减毒的蓖麻毒素a链突变体;
或,所述低毒或减毒的蓖麻毒素a链突变体为如下1)-4)中任一种:
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
3)将序列表中序列2或序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质;
4)将序列表中序列2或序列4所示的氨基酸序列添加标签序列得到的蛋白质。
上述方法中,所述免疫原由抗原和佐剂组成;
或,所述动物为马、猪、羊或骆驼。
上述方法中,所述免疫原免疫动物制备蓖麻毒素igg的方法包括如下步骤:将所述免疫原免疫所述马,收集效价不低于1:64000时的血浆,即得到蓖麻毒素igg;
或,所述免疫原的免疫方式为:免疫4次,每次间隔间隔21天,每次免疫的剂量依次为4.0、4.0、5.0、6.0mg。
所述方法中,所述将蓖麻毒素igg去除fc段采用胃蛋白酶切割,具体为将纯化抗蓖麻毒素igg用盐酸调ph至3.2后加入终浓度为20iu/ml胃蛋白酶(sigmap7000)33℃切割2小时,再用氢氧化钠调ph至7.4,加热58℃、30min,用帆布过滤去fc段,收集滤液为抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2。
由上述方法制备的抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2也是本发明保护的范围。
上述的抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2在制备治疗和/或预防由蓖麻毒素引发的疾病物质产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种产品。
本发明提的产品,其活性成分为上述的抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2。
上述产品中,所述产品的功能为治疗和/或预防由蓖麻毒素引发的疾病;
或,所述产品的剂型为注射剂型或粘膜剂型,也可以为别的剂型;
或,所述产品为疫苗或试剂盒。
上述的抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2或上述的产品在治疗和/或预防由蓖麻毒素引发的疾病中的应用也是本发明保护的范围。
所述方法中,所述脱毒的天然蓖麻毒素按照如下方法制备:从蓖麻籽中获得蓖麻毒蛋白粗品,再将所述蓖麻毒蛋白粗品进行亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析,收集得到纯化蓖麻毒素;再将所述纯化蓖麻毒素用甲醛脱毒处理,得到脱毒的纯化蓖麻毒素;具体如下:
1、粗制品抗原的制备:称取500.0g去壳蓖麻籽,用5mmol/l磷酸缓冲液(pbs,ph6.5,含100mmol/lnacl,缓冲液a)中匀浆。匀浆液于4℃放置2-3小时。用四层纱布滤去残渣,过滤后的溶液于4℃下20000×g离心30min。小心除去沉淀和溶液表面白色脂肪,取上清。在上清液中加入固体(nh4)2so4达到60%饱和度。4℃放置2-3小时,在4℃下20000×g离心30min。倒去上清,把沉淀溶解在适量缓冲液a中,并在4℃透析24小时,然后在4℃下20000×g离心10min,去上清液即为蓖麻毒蛋白粗品。lowry法测定蛋白含量为3.0mg/ml,分装,放置-70℃备用。
2、纯品抗原的制备:
将上述1得到的蓖麻毒蛋白粗品按照如下步骤纯化:
1)亲和层析
取50mlconasepharose4b(ge)亲和凝胶介质缓慢装入xk26/20(ge)的层析柱,然后用3倍柱体积的洗脱液(tris-hcl20mm/l、nacl0.5m/l、甲基-α-d葡萄糖苷200mm/l,ph为7.2),再用3倍柱体积的平衡液平衡(tris-hcl20mm/l、nacl0.5m/l、cacl21mm/l、mncl21mm/l,ph为7.2);(2)蓖麻毒素抗原粗品经0.22μm的滤器过滤后上样,调整蛋白浓度20mg/ml左右,流速1.5ml/min;(3)平衡液洗涤凝胶以除去未结合蛋白,然后以洗脱液对蛋白进行一次性洗脱,流速1.5ml/min,整个收集过程紫外监测蛋白峰。
2)凝胶过滤层析
sephadexg-50(ge)凝胶介质装入xk16/70(ge)层析柱,3倍柱体积1mnaoh清洗层析柱,3倍柱床体积纯化水清洗层析柱,3倍柱床体积脱盐平衡液(tris-hcl20mm/l,ph为8.0)平衡层析柱;(2)蓖麻毒素蛋白体积约20ml,流速1ml/min;(3)用平衡液(tris-hcl20mm/l,ph为8.0)进行洗脱,流速1ml/min,紫外监测收集蛋白峰。
3)离子交换层析
50mlqsepharos4ff(ge)凝胶介质装入xk26/20(ge)的凝胶层析柱,3倍柱床体积的1mnaoh清洗层析柱,3倍柱床体积纯化水清洗层析柱,然后用平衡缓冲液(tris-hcl20mm/l,ph为8.0)平衡层析柱至流出液的ph与平衡缓冲液相同;(2)蓖麻毒素样本流速5ml/min;(3)用洗脱液(tris-hcl20mm/l,nacl100mm/l,ph为7.2)进行洗脱,流速5ml/min,紫外监测蛋白收集峰,得到纯化蓖麻毒素。
3、脱毒
将上述2得到的纯化蓖麻毒素和甲醛按照1:4000(v/v)浓度甲醛,室温(20~25℃)脱毒96h,得到将脱毒的纯化蓖麻毒素抗原溶液。
将脱毒的纯化蓖麻毒素抗原溶液放透析袋(截留分子量为8000-14000d)浓缩、再用生理盐水平衡,再经过0.22μm除菌滤膜对脱毒的纯化蓖麻毒素液除菌,得到脱毒的纯化蓖麻毒素。
lowry法测脱毒的纯化蓖麻毒素的蛋白含量3mg/ml。
将脱毒的纯化蓖麻毒素抗原经hplc法测定,纯度为91%,并通过maldi-tof/ms与esi-ms测定蛋白质分子量是63kda。
本发明利用无毒或低毒的蓖麻毒素抗原免疫健康动物,产生高效价中和蓖麻毒素的抗血清,去除能引起副作用的fc片段,制备抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2,能特异中和蓖麻毒素,对蓖麻毒素的治疗和预防有特异性保护效果;有效治疗与预防蓖麻毒素,是非常有价值的治疗性和预防性抗体药物。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2抗体的制备
一、蓖麻毒素免疫原的制备与鉴定
(一)重组蓖麻毒素蛋白mtrta的获得
重组蓖麻毒素蛋白mtrta的氨基酸序列为序列2,其编码基因的核苷酸序列为序列1。
mtrta是将蓖麻毒素a链改造后得到的低毒蛋白(专利公开号:201010552949.4)
制备过程如下:
1、表达重组蓖麻毒素蛋白的工程菌的制备
表达重组蓖麻毒素蛋白的工程菌mtrta/pet-his/bl21(de3)为将质粒mtrta/pet-his导入大肠杆菌bl21(de3)得到的菌株。
质粒mtrta/pet-his为将mtrta(序列1)基因插入pet-his(孙嗣梅,王景林等.重组蓖麻毒素a链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析.中国生物工程杂志.2005,25(4):47-51.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)的ecorⅰ和nheⅰ双酶切位点间得到的载体,mtrta基因与载体上的his基因融合表达重组蓖麻毒素蛋白mtrta。
2、工程菌表达重组蓖麻毒素蛋白mtrta
将工程菌mtrta/pet-his/bl21(de3)进行诱导表达和镍柱纯化得到重组蓖麻毒素蛋白mtrta,具体如下:
(1)将工程菌mtrta/pet-his/bl21(de3)按1:100转接到含有6mllb(amp)液体培养基的试管中,将试管置于37℃,200r/m的摇床中进行培养至菌液在od600约0.6时,加入诱导剂iptg至终浓度0.4mm,改变诱导温度至20℃,其余培养条件不变继续培养,诱导完成后离心收集菌体,用约100ml的超声裂解液悬浮菌体并冰浴超声破碎菌体,超声结束后继续离心分离上清和沉淀,上清液过0.45μm孔径的滤膜后,存放于4℃冰箱待用。
(2)将镍柱安装到aktaprimeplus蛋白纯化仪上,先用蛋白纯化a液(5mmpb,ph7.2)平衡系统,将蛋白上清液以3ml/min的速度从a泵上样穿过镍柱,同时收集穿透液,上样完成后再次用蛋白纯化a液平衡至代表紫外吸收值的蓝线平衡。然后分别以不同比例的蛋白纯化a、b混合液洗脱目的蛋白,当代表紫外吸收值的蓝线开始上升时,及时收集蛋白洗脱液,每2-3ml洗脱液分开收集在不同的小试管中,分别取这些洗脱样品进行sds-page电泳,将电泳结果显示只含有目的蛋白条带对应的洗脱液收集以备下一步透析除去咪唑,得到纯化重组蓖麻毒素蛋白mtrta(分子量为25kda)。
对纯化重组蓖麻毒素蛋白mtrta的纯化效果分析,经电泳测算其纯度大于98%。
(二)重组蓖麻毒素蛋白rrta的制备
rrta蛋白的氨基酸序列为序列4,其编码基因的核苷酸序列为序列3。
rrta是将蓖麻毒素a链改造后得到,专利公开号:201010552949.4。
制备过程如下:
1、表达重组蓖麻毒素蛋白的工程菌的制备
表达重组蓖麻毒素蛋白的工程菌rrta/pet-his/bl21(de3)为将质粒rrta/pet-his导入大肠杆菌bl21(de3)得到的菌株。
质粒rrta/pet-his为将rrta基因(序列3)插入pet-his(孙嗣梅,王景林等.重组蓖麻毒素a链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析.中国生物工程杂志.2005,25(4):47-51.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)的ecorⅰ和nheⅰ双酶切位点间得到的载体,rrta基因与载体上的his基因融合表达重组蓖麻毒素蛋白rrta。
2、工程菌表达重组蓖麻毒素蛋白rrta
与(一)的2相同,得到重组蓖麻毒素蛋白rrta,分子量为25±2kd。
lowry法测重组蓖麻毒素蛋白rrta,蛋白含量3mg/ml,分装,放置-70℃冰箱备用。
(三)、源于天然蓖麻毒素的脱毒纯化蓖麻毒素的制备
1、粗制品抗原的制备:称取500.0g去壳蓖麻籽,用5mmol/l磷酸缓冲液(pbs,ph6.5,含100mmol/lnacl,缓冲液a)中匀浆。匀浆液于4℃放置2-3小时。用四层纱布滤去残渣,过滤后的溶液于4℃下20000×g离心30min。小心除去沉淀和溶液表面白色脂肪,取上清。在上清液中加入固体(nh4)2so4达到60%饱和度。4℃放置2-3小时,在4℃下20000×g离心30min。倒去上清,把沉淀溶解在适量缓冲液a中,并在4℃透析24小时,然后在4℃下20000×g离心10min,去上清液即为蓖麻毒蛋白粗品。lowry法测定蛋白含量为3.0mg/ml,分装,放置-70℃备用。
2、纯品抗原的制备:
将上述1得到的蓖麻毒蛋白粗品按照如下步骤纯化:
1)亲和层析
取50mlconasepharose4b(ge)亲和凝胶介质缓慢装入xk26/20(ge)的层析柱,然后用3倍柱体积的洗脱液(tris-hcl20mm/l、nacl0.5m/l、甲基-α-d葡萄糖苷200mm/l,ph为7.2),再用3倍柱体积的平衡液平衡(tris-hcl20mm/l、nacl0.5m/l、cacl21mm/l、mncl21mm/l,ph为7.2);(2)蓖麻毒素抗原粗品经0.22μm的滤器过滤后上样,调整蛋白浓度20mg/ml左右,流速1.5ml/min;(3)平衡液洗涤凝胶以除去未结合蛋白,然后以洗脱液对蛋白进行一次性洗脱,流速1.5ml/min,整个收集过程紫外监测蛋白峰。
2)凝胶过滤层析
sephadexg-50(ge)凝胶介质装入xk16/70(ge)层析柱,3倍柱体积1mnaoh清洗层析柱,3倍柱床体积纯化水清洗层析柱,3倍柱床体积脱盐平衡液(tris-hcl20mm/l,ph为8.0)平衡层析柱;(2)蓖麻毒素蛋白体积约20ml,流速1ml/min;(3)用平衡液(tris-hcl20mm/l,ph为8.0)进行洗脱,流速1ml/min,紫外监测收集蛋白峰。
3)离子交换层析
50mlqsepharos4ff(ge)凝胶介质装入xk26/20(ge)的凝胶层析柱,3倍柱床体积的1mnaoh清洗层析柱,3倍柱床体积纯化水清洗层析柱,然后用平衡缓冲液(tris-hcl20mm/l,ph为8.0)平衡层析柱至流出液的ph与平衡缓冲液相同;(2)蓖麻毒素样本流速5ml/min;(3)用洗脱液(tris-hcl20mm/l,nacl100mm/l,ph为7.2)进行洗脱,流速5ml/min,紫外监测蛋白收集峰。
得到纯化蓖麻毒素。
通过lowry法测定纯化蓖麻毒素的蛋白含量为0.75mg/ml,分装,放-70℃保存备用。
3、脱毒
将上述2得到的纯化蓖麻毒素和甲醛按照1:4000(v/v)浓度甲醛,室温(20~25℃)脱毒96h,得到将脱毒的纯化蓖麻毒素抗原溶液。
将脱毒的纯化蓖麻毒素抗原溶液放透析袋(截留分子量为8000-14000d)浓缩、再用生理盐水平衡,再经过0.22μm除菌滤膜对脱毒的纯化蓖麻毒素液除菌,得到脱毒的纯化蓖麻毒素。
lowry法测脱毒的纯化蓖麻毒素的蛋白含量3mg/ml,分装,放置-70℃冰箱备用。
将脱毒的纯化蓖麻毒素抗原经hplc法测定,纯度为91%,并通过maldi-tof/ms与esi-ms测定蛋白质分子量是63kda。
由此,通过该制备方法获得了较为理想的脱毒纯化蓖麻毒素。
4、脱毒纯化蓖麻毒素对balb/c小鼠ld50测定
balb/c小鼠30只,5只/组,共六组。腹腔注射脱毒后蓖麻毒素的量分别为0.02μg、0.04μg、0.06μg、0.08μg、0.10μg、0.12μg,每只注射剂量为0.2ml。每天观察并记录小鼠存活数,根据reed-munch公式计算balb/c小鼠半数致死量(ld50)。
结果表明,脱毒后蓖麻毒素对balb/c小鼠的ld50为0.063μg。
二、抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2制备纯化
(一)免疫原的制备及免疫程序
1、免疫原的制备
将上述一制备的重组蓖麻毒素蛋白mtrta、重组蓖麻毒素蛋白rrta和脱毒纯化蓖麻毒素分别加入不完全弗氏佐剂(或其它佐剂)乳化,得到不同免疫原。
2、免疫
将上述不同免疫原采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的动物(在本实施例中是注射马),间隔21天,免疫四次,各组免疫剂量均为4.0、4.0、5.0、6.0mg。当免疫动物elisa效价不低于1:64000时采集血浆,-70℃保存备用。
(二)抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2制备及纯化
1、抗蓖麻毒素igg的获得
向上述一收集的血浆中加入1/10体积的s/d病毒灭活溶液(tritonx-10010%,tnbp3%)灭活外源病毒,25℃静置6h;再加入0.074%硅藻土(w/v),搅拌后用板框压滤压滤,弃沉淀,收集上清液;再向上清液中加入9%饱和度硫酸铵混匀离心,收集沉淀,得到抗蓖麻毒素igg粗品;
用无热源蒸馏水溶解抗蓖麻毒素igg粗品恢复原体积,再用30%饱和度的硫酸铵混匀,静置收集沉淀;再将沉淀加入1.5-2倍体积的的无热源蒸馏水、无热源0.9%氯化钠盐水溶解,用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白,收集超滤液,得到纯化抗蓖麻毒素igg。
2、抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2制备
将上述1得到的纯化抗蓖麻毒素igg用盐酸调ph至3.2后加入终浓度为20iu/ml胃蛋白酶(sigmap7000)33℃切割2小时,再用氢氧化钠调ph至7.4,加热58℃、30min,用帆布过滤去fc段,收集滤液为抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2。
3、纯化抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2
将上述2获得的抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2过deaesepharosefastflow层析(层析住xk26/20(ge)),柱平衡后,样品液上柱,用10mmpb,1mnacl(ph7.0)缓冲液10ml/min洗脱,收集样品峰,再用6万超滤器超滤除盐、浓缩,收集超滤液;再将超滤液用0.22μm除菌滤膜除菌,置2-8℃冷库保存,为纯化抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2,得到重组蓖麻毒素蛋白mtrta作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2、重组蓖麻毒素蛋白rrta作为免疫原作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2和脱毒纯化蓖麻毒素作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2。
4、抗蓖麻毒素免疫球蛋白成品的制备
将上述3得到的纯化马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2加入适量硫柳汞防腐剂,用生理盐水稀释所需含量,0.22um除菌分装,制备抗蓖麻毒素免疫球蛋白注射剂型成品。也可以做成粘膜剂型或其他剂型。
上述方法得到:
重组蓖麻毒素蛋白mtrta作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品、重组蓖麻毒素蛋白rrta作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品和脱毒纯化蓖麻毒素作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品。
三、抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2抗体的安全性检定
1、精制抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2的检定
按照一和二的方法制备三种马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2经检定(2015版《中国药典》)为无色或淡黄色透明液体,纯度高于95%,无异常毒性,无菌,无热原,无过敏反应,无溶血,无局部刺激反应,效价高于10000u/瓶。
2、抗蓖麻毒素免疫球蛋白成品的检测
将上述二得到的三种马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品,通过免疫组化证实与正常人心、肝、肺、肾、脑、脾、淋巴结、肠组织器官没有交叉反应,证实抗蓖麻毒素免疫球蛋白注射剂型成品没有抗人的组织成分,用于人的防治是安全的。
四、抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2的稳定性检定
将上述二得到的三种马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品放4℃观察稳定性(观色泽、可见异物、ph值、f(ab′)2含量、中和抗体活性和无菌试验),实验证实抗蓖麻毒素免疫球蛋白4℃放置18个月以上中和效价不减,有很好的稳定性。
将上述二得到的三种马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品放37℃,通过加速试验观察稳定性(观色泽、可见异物、ph值、f(ab′)2含量、中和抗体活性和无菌试验),实验证实抗蓖麻毒素免疫球蛋白37℃放置3个月以上中和效价不减,6个月时略有下降,具有很好的稳定性。
上述中和抗体活性检测方法:balb/c小鼠5只/组。用0.01mpbs(ph7.2)对蓖麻毒素稀释2ld50/0.2ml;用0.01mpbs(ph7.2)将马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2按一定比例稀释,按终体积0.2ml/梯度分别加入0.2ml蓖麻毒素,37℃温箱孵育1小时,同时设正常马免疫球蛋白对照组。将中和后的混合液腹腔注射balb/c小鼠0.4ml/只,每天观察小鼠死亡情况,连续观察72小时,小鼠为死亡即为活性终点。
实施例2、精制抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2对balb/c小鼠的治疗和预防效果评价
一、不同免疫原得到的抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2的免疫原性比较
采用中和抗体效价检测,具体如下:
实施例1的(三)中的纯化蓖麻毒素(天然蓖麻毒素)pbs稀释为2ld50/0.2ml,应用实施例1制备的重组蓖麻毒素蛋白mtrta作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品、重组蓖麻毒素蛋白rrta作为免疫原作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品和脱毒纯化蓖麻毒素作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2注射剂型成品分别1000、2000、4000、6000倍稀释,取0.2ml与2ld50/0.2ml天然蓖麻毒素37℃中1小时,腹腔注射体重18-20g的balb/c小鼠,0.4ml/只,以2ld50/0.2ml、1ld50/0.2ml腹腔注射体重18-20g的balb/c小鼠为对照,0.2ml/只,连续3天观察小鼠的死亡情况,计算各抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2的抗体效价。
结果如表1所示:
表1为各抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2效价检测
上述结果显示,三种马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2均抗蓖麻毒素,有免疫效果,其中,脱毒纯化蓖麻毒素作为免疫原制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2效价最高,效果最好。
二、精制抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2对balb/c小鼠的治疗和预防效果评价
下面实验采用马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型为脱毒纯化蓖麻毒素作为免疫原制备得到的。
a、治疗
1、感染动物模型的制备
选用balb/c小鼠25只,体重18-20g,分7组,5只/组,称体重。用0.01mpbs(ph7.2)稀释实施例1的一的(三)的制备的纯化蓖麻毒素(天然蓖麻毒素),每只小鼠腹腔注射5ld50/0.2ml建立感染动物模型。
2、免疫
分别于注射蓖麻毒素后的第2、3、4、5小时静脉注射用0.01mpbs(ph7.2)稀释的实施例1制备的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型25u(62.5mg)/0.2ml,每天称量小鼠体重,并记录死亡等情况。
结果表明,当腹腔注射5ld50蓖麻毒素感染balb/c小鼠发病后,分别在第2、3、4小时静脉注射抗蓖麻毒素免疫球蛋白注射剂型,发病的小鼠注射蓖麻毒素后144小时全部存活,给药后体重虽有下降,但于给药后的第7天小鼠体重均恢复至注射毒素前体重;而5小时后给予马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2试制品在小鼠注射蓖麻毒素后于144小时全部死亡;而没有给予马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2的对照组小鼠48小时内全部死亡。
上述结果显示,当蓖麻毒素感染balb/c小鼠用量5ld50所建立的模型,给予马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2治疗剂量为1250u(3.125mg)/kg(也就是前面的25u(62.5mg)/0.2ml)体重时,在感染4小时内用药有好的治疗效果,4小时后治疗其效果差或无效。
b、预防
1、免疫
选用balb/c小鼠25只,体重18-20g,分5组,5只/组,称体重。用0.01mpbs(ph7.2)1:400稀释马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型,每只小鼠静脉注射0.2ml,剂量为1250u(3.125mg)/kg体重;对照组每只小鼠注射同等量的0.01mpbs(ph7.2)0.2ml。
2、攻毒
分别于注射马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)后的第3、4、5、6天腹腔注射用0.01mpbs(ph7.2)稀释的实施例1的一的(三)的制备的纯化蓖麻毒素(天然蓖麻毒素)5ld50,每天称量小鼠体重,并记录死亡等情况。
结果表明,当balb/c小鼠腹腔注射用量为1250u(3.125mg)/kg体重的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2时,分别于第3、4、5天注射5ld50蓖麻毒素后,给药的小鼠均未见死亡,但到给蓖麻毒素的7天后体重均可恢复至给药前体重;而给药后第6天注射蓖麻毒素的小鼠,于注射毒素72小时内全部死亡;对照组在注射蓖麻毒素后48小时内全部死亡。
由上结果显示,当给予balb/c小鼠用量为1250u(3.125mg)/kg体重的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2制品预防剂量时,用蓖麻毒素感染balb/c小鼠,5天内可有效预防蓖麻毒素中毒感染,而5天后预防效果差或无预防效果。
实施例3、精制抗蓖麻毒素免疫球蛋白在恒河猴体内治疗效果评价
实施例中采用马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型为脱毒纯化蓖麻毒素作为免疫原制备得到的。
1、感染动物
用0.01mpbs(ph7.2)配制成72μg/ml实施例1的一的(三)的制备的纯化蓖麻毒素(天然蓖麻毒素)腹腔注射恒河猴(体重5.5-6.3kg,雌雄各半)15只,得到感染动物模型。
2、免疫
在注射蓖麻毒素后的第4小时,感染动物模型中5只恒河猴给予0.01mpbs(ph7.2)稀释的马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型3000u(7.5mg)/ml,5只恒河猴给予马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型5000u(12.5mg)/ml,另外5只恒河猴腹腔注射同体积的0.01mpbs(ph7.2)作为对照组。连续观察7天,7天后分别处死猴,取肝、脾、肺、肾组织用4%福尔马林固定做组织病理观察。
结果表明,感染动物模型中5只恒河猴在给予马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型3000u后的第8个小时均出现厌食,情绪躁动,48小时后逐渐开始进食,明显好转;感染动物模型中5只恒河猴在给予马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)注射剂型25000u后的第10个小时有1只不进食,到24小时开始进食,状态好转,逐渐恢复正常,而另外4只未见异常变化。连续观察7天后,10只恒河猴均全部存活,生命体征正常;而对照pbs组在2天内全部死亡。
病理检测结果表明,中毒后的恒河猴肺脏有大量炎性细胞渗出;肝脏基质细胞大量坏死;脾脏淋巴细胞大量减少;肾脏有少量炎性细胞渗出;渗出的炎性细胞以中性粒细胞为主,尤其是肺脏,几乎都是中性粒细胞。治疗后的恒河猴肝、脾、肺、肾组织正常,肾脏有微量炎性细胞渗出,为正常组织形态。此外,正常恒河猴肝、脾、肺、肾组织均表现为正常组织形态。
由此可见,马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2制品在恒河猴体内对蓖麻毒素中毒有很好的治疗效果,为马抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab’)2进入临床研究提供了实验证据。
序列表
<110>中国人民解放军第三0二医院中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120>一种抗蓖麻毒素免疫球蛋白f(ab')2及其制备方法
<160>4
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