本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法。
背景技术：
生物标记物(biomarker)是近年来随着免疫学和分子生物学技术的发展而提出的一类与细胞生长增殖有关的标志物。生物标记物(biomarker)[1]不仅可从分子水平探讨发病机制，而且在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警，很大程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。
抗体（antibody），（免疫球蛋白不仅仅只是抗体）是一种由浆细胞（效应b细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其b细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。抗体能够用于生物标记物的筛选，但是缺乏大量生产抗体的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，包括以下步骤：
s1、动物的选择与免疫，选择纯种balb/c小鼠进行免疫；
s2、细胞融合：
a1、制备饲养细胞层：选取balb/c小鼠，7-9周，处死，浸泡在75%酒精内，3-5min，剪开皮肤暴露腹膜，注入5-6ml预冷的培养液，反复冲洗吸出冲洗液，离心分离，用20%小牛血清的培养液混悬，加入96孔板；
a2、制备免疫脾细胞：取s1中加强免疫的小鼠处死，取脾研碎，用培养液洗2次，取脾淋巴细胞悬液备用；
a3、制备骨髓细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得细胞备用；
a4、融合；
s3、选择培养：使用hat选择培养7-10天，之后使用ht培养液培养2周，之后采用一般培养液；
s4、杂交瘤克隆化；
s5、克隆抗体的大量生产：
b1、先腹腔注射0.5mlpristane或液体石蜡于balb/c鼠；
b2、1-2周后腹腔注射杂交瘤细胞；
b3、密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。
优选的，小鼠免疫具体步骤如下：
c1、初次免疫，抗原5-30μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射，一般0.5-1ml，0.25ml/点；
c2、二次免疫，3周后进行，剂量与初次相等，加福氏不完全佐剂皮下或ip，腹腔内注射；
c3、三次免疫，3周后进行，剂量与上次相等，不加佐剂、ip；
c4、加强免疫，2-3周后进行，剂量100-400μg为宜，ip或iv，静脉注射。
优选的，a4中融合的具体步骤如下：
d1、将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1250rpm，5min；
d2、弃上清，用吸管吸净残留液体，90s内加入37.5℃预温的1ml45%peg溶液，边加边轻微摇动；
d3、37.5℃水浴作用90s；加37.5℃预温的不完全培养液以终止peg作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；
d4、离心，800rpm，6min；
d5、弃上清，用含20%小牛血清hat选择培养液重悬；
d6、将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl；
d7、将培养板置37.5℃、5%co2培养箱中培养。
本发明提出的一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，有益效果在于：本发明提出了一种能够量产抗体的方法，过程简单，成本低，应用广泛，适用于生物标记物筛选用抗体的生成。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，包括以下步骤：
s1、动物的选择与免疫，选择纯种balb/c小鼠进行免疫；
s2、细胞融合：
a1、制备饲养细胞层：选取balb/c小鼠，7周，处死，浸泡在75%酒精内，3min，剪开皮肤暴露腹膜，注入5ml预冷的培养液，反复冲洗吸出冲洗液，离心分离，用20%小牛血清的培养液混悬，加入96孔板；
a2、制备免疫脾细胞：取s1中加强免疫的小鼠处死，取脾研碎，用培养液洗2次，取脾淋巴细胞悬液备用；
a3、制备骨髓细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得细胞备用；
a4、融合；
s3、选择培养：使用hat选择培养7天，之后使用ht培养液培养2周，之后采用一般培养液；
s4、杂交瘤克隆化；
s5、克隆抗体的大量生产：
b1、先腹腔注射0.5mlpristane或液体石蜡于balb/c鼠；
b2、1周后腹腔注射杂交瘤细胞；
b3、密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。
小鼠免疫具体步骤如下：
c1、初次免疫，抗原5μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射，一般0.5ml，0.25ml/点；
c2、二次免疫，3周后进行，剂量与初次相等，加福氏不完全佐剂皮下或ip，腹腔内注射；
c3、三次免疫，3周后进行，剂量与上次相等，不加佐剂、ip；
c4、加强免疫，2周后进行，剂量100μg为宜，ip或iv，静脉注射。
a4中融合的具体步骤如下：
d1、将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1250rpm，5min；
d2、弃上清，用吸管吸净残留液体，90s内加入37.5℃预温的1ml45%peg溶液，边加边轻微摇动；
d3、37.5℃水浴作用90s；加37.5℃预温的不完全培养液以终止peg作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；
d4、离心，800rpm，6min；
d5、弃上清，用含20%小牛血清hat选择培养液重悬；
d6、将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl；
d7、将培养板置37.5℃、5%co2培养箱中培养。
实施例2
一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，包括以下步骤：
s1、动物的选择与免疫，选择纯种balb/c小鼠进行免疫；
s2、细胞融合：
a1、制备饲养细胞层：选取balb/c小鼠，8周，处死，浸泡在75%酒精内，3.5min，剪开皮肤暴露腹膜，注入5.5ml预冷的培养液，反复冲洗吸出冲洗液，离心分离，用20%小牛血清的培养液混悬，加入96孔板；
a2、制备免疫脾细胞：取s1中加强免疫的小鼠处死，取脾研碎，用培养液洗2次，取脾淋巴细胞悬液备用；
a3、制备骨髓细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得细胞备用；
a4、融合；
s3、选择培养：使用hat选择培养8天，之后使用ht培养液培养2周，之后采用一般培养液；
s4、杂交瘤克隆化；
s5、克隆抗体的大量生产：
b1、先腹腔注射0.5mlpristane或液体石蜡于balb/c鼠；
b2、1周后腹腔注射杂交瘤细胞；
b3、密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。
小鼠免疫具体步骤如下：
c1、初次免疫，抗原6μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射，一般0.6ml，0.25ml/点；
c2、二次免疫，3周后进行，剂量与初次相等，加福氏不完全佐剂皮下或ip，腹腔内注射；
c3、三次免疫，3周后进行，剂量与上次相等，不加佐剂、ip；
c4、加强免疫，2周后进行，剂量200μg为宜，ip或iv，静脉注射。
a4中融合的具体步骤如下：
d1、将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1250rpm，5min；
d2、弃上清，用吸管吸净残留液体，90s内加入37.5℃预温的1ml45%peg溶液，边加边轻微摇动；
d3、37.5℃水浴作用90s；加37.5℃预温的不完全培养液以终止peg作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；
d4、离心，800rpm，6min；
d5、弃上清，用含20%小牛血清hat选择培养液重悬；
d6、将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl；
d7、将培养板置37.5℃、5%co2培养箱中培养。
实施例3
一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，包括以下步骤：
s1、动物的选择与免疫，选择纯种balb/c小鼠进行免疫；
s2、细胞融合：
a1、制备饲养细胞层：选取balb/c小鼠，8周，处死，浸泡在75%酒精内，4min，剪开皮肤暴露腹膜，注入5.5ml预冷的培养液，反复冲洗吸出冲洗液，离心分离，用20%小牛血清的培养液混悬，加入96孔板；
a2、制备免疫脾细胞：取s1中加强免疫的小鼠处死，取脾研碎，用培养液洗2次，取脾淋巴细胞悬液备用；
a3、制备骨髓细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得细胞备用；
a4、融合；
s3、选择培养：使用hat选择培养9天，之后使用ht培养液培养2周，之后采用一般培养液；
s4、杂交瘤克隆化；
s5、克隆抗体的大量生产：
b1、先腹腔注射0.5mlpristane或液体石蜡于balb/c鼠；
b2、2周后腹腔注射杂交瘤细胞；
b3、密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。
小鼠免疫具体步骤如下：
c1、初次免疫，抗原20μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射，一般0.8ml，0.25ml/点；
c2、二次免疫，3周后进行，剂量与初次相等，加福氏不完全佐剂皮下或ip，腹腔内注射；
c3、三次免疫，3周后进行，剂量与上次相等，不加佐剂、ip；
c4、加强免疫，3周后进行，剂量300μg为宜，ip或iv，静脉注射。
a4中融合的具体步骤如下：
d1、将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1250rpm，5min；
d2、弃上清，用吸管吸净残留液体，90s内加入37.5℃预温的1ml45%peg溶液，边加边轻微摇动；
d3、37.5℃水浴作用90s；加37.5℃预温的不完全培养液以终止peg作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；
d4、离心，800rpm，6min；
d5、弃上清，用含20%小牛血清hat选择培养液重悬；
d6、将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl；
d7、将培养板置37.5℃、5%co2培养箱中培养。
实施例4
一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法，包括以下步骤：
s1、动物的选择与免疫，选择纯种balb/c小鼠进行免疫；
s2、细胞融合：
a1、制备饲养细胞层：选取balb/c小鼠，9周，处死，浸泡在75%酒精内，5min，剪开皮肤暴露腹膜，注入6ml预冷的培养液，反复冲洗吸出冲洗液，离心分离，用20%小牛血清的培养液混悬，加入96孔板；
a2、制备免疫脾细胞：取s1中加强免疫的小鼠处死，取脾研碎，用培养液洗2次，取脾淋巴细胞悬液备用；
a3、制备骨髓细胞：取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数，取得细胞备用；
a4、融合；
s3、选择培养：使用hat选择培养10天，之后使用ht培养液培养2周，之后采用一般培养液；
s4、杂交瘤克隆化；
s5、克隆抗体的大量生产：
b1、先腹腔注射0.5mlpristane或液体石蜡于balb/c鼠；
b2、2周后腹腔注射杂交瘤细胞；
b3、密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。
小鼠免疫具体步骤如下：
c1、初次免疫，抗原30μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射，一般1ml，0.25ml/点；
c2、二次免疫，3周后进行，剂量与初次相等，加福氏不完全佐剂皮下或ip，腹腔内注射；
c3、三次免疫，3周后进行，剂量与上次相等，不加佐剂、ip；
c4、加强免疫，3周后进行，剂量400μg为宜，ip或iv，静脉注射。
a4中融合的具体步骤如下：
d1、将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1250rpm，5min；
d2、弃上清，用吸管吸净残留液体，90s内加入37.5℃预温的1ml45%peg溶液，边加边轻微摇动；
d3、37.5℃水浴作用90s；加37.5℃预温的不完全培养液以终止peg作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；
d4、离心，800rpm，6min；
d5、弃上清，用含20%小牛血清hat选择培养液重悬；
d6、将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl；
d7、将培养板置37.5℃、5%co2培养箱中培养。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。