倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-NV及其基因和应用的制作方法

本发明涉及一种倭蛙(nanoranaventripunctata)皮肤修复肽cathelicidin-nv及其基因和应用，属于生物医学领域。

背景技术：

皮肤是机体与外界接触的第一道屏障，是机体免于脱水、损伤、感染的第一道防线，是维持内环境稳定和阻止微生物、化学物质等侵入的屏障。炎症、溃疡、严重烧伤、创伤、肿瘤术后以及先天性畸形等多种急慢性损伤引起的大面积的皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡，会引发许多局部与全身各系统的反应。皮肤缺损后细菌极易入侵繁殖，会引起机体水电解质紊乱、败血症休克、高代谢反应、多脏器功能衰竭等，使机体不能维持正常的自稳状态，甚至导致死亡。慢性皮肤溃疡的预后很差，其危害已不容忽视。由于该病慢性迁延、难以治愈且消耗甚大，给患者造成了很大的心理压力，严重影响患者的身体状况及生活质量。因此，开发出安全高效的促皮肤愈合药物，减少其发病率、降低其致残率、死亡率，从而减轻由此而产生的社会问题，提高广大患者的生活质量，已成为当前医药企业和科研工作者亟待解决的问题。

两栖动物是生物活性多肽资源发掘中最重要的一类资源，其皮肤裸露，为抵御环境中各种恶劣环境，它们能够分泌多种分子结构新颖、功能复杂多样的的生物活性多肽。这些活性多肽广泛参与机体的各种生理活动，具有各种药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、创伤修复、镇痛等作用。目前，从两栖动物皮肤中筛选一些药理活性单体化合物是新药发明的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床阶段。腹斑倭蛙相比较其它蛙科动物其生活环境极为严酷，那里有长时间持续的日光照射，强烈的紫外线辐射以及高原寒冷、低压缺氧、干燥及强风的气候特点。这种特异的恶劣生态环境使得它们面临的内外应激因素以及外界微生物的侵袭都与其他的两栖动物有所差异。特殊的高原低氧寒冷的环境必然赋予这个物种会产生特殊的一些物质来适应这种恶劣的环境。腹斑倭蛙(nanoranaventripunctata)为两栖纲无尾目蛙科倭蛙属的两栖动物，为中国特有物种，是青藏高原的特有种属，其皮肤分泌物中cathelicidin家族的促皮肤修复肽尚无报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的具有强效促皮肤修复作用的倭蛙(nanoranaventripunctata)皮肤修复肽cathelicidin-nv及其基因和应用。

本发明的皮肤修复肽cathelicidin-nv是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量2845.9道尔顿，等电点9.90，多肽全序列一级结构(氨基酸序列seqidno:1)为：

argkkeckddrcrllmkrgsfsyv(24aa)，其第七位半胱氨酸和第十二位半胱氨酸组成一对分子内二硫键。

该皮肤修复肽前体的编码基因由652个核苷酸(seqidno:2)组成，其自5’端至3’端序列为:

其中，第367–438位核苷酸为成熟皮肤修复肽cathelicidin-nv的编码基因。

本发明的倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备促皮肤创伤修复治疗药物中的应用。

本发明的有益效果在于：提供一种新的具有强效促皮肤修复活性的倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv,该倭蛙促皮肤修复肽具有显著的促皮肤创伤修复作用，能够在制备促皮肤创伤修复治疗药物中应用。

附图说明

附图1显示使用反相高压液相分离纯化倭蛙皮肤分泌液，箭头所示为具有促皮肤修复的组分。

附图2显示使用反相高压液相进一步纯化该组分，箭头所示为纯化的皮肤修复肽cathelicidin-nv。

附图3显示腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv促皮肤修复的作用。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作详细说明。

一、腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv的制备和氨基酸序列测定

1、收集腹斑倭蛙皮肤分泌液

活体腹斑倭蛙用水清洗干净，置于直径10厘米，高10厘米的圆柱体样品瓶中。乙醚刺激2分钟后，用10ml0.1mph6.0的磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗蛙背部泡沫液体。将该分泌液于4℃条件下12000rpm离心15分钟，上清于-80℃保存。

2、腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv的分离纯化

以上述收集的上清液为原料，按照下述程序纯化腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv，分离纯化的每个组分都进行促皮肤修复检测，具体方法如下：

(a)采用美国millipore公司的超滤管将上清液中分子量大于10kda的物质去除。上清液加入超滤管(10kda，15ml)中进行第一次离心(3000×g，40分钟)，收集滤液，再进行第二次离心(3000×g，10分钟)，收集滤液，再进行第三次离心(3000×g，5分钟)，收集剩余的滤液，于-20℃保存。

(b)上述的滤液采用反相高压液相(rp-hplc)c18色谱柱进行纯化，该步骤在美国waters公司的2795四元梯度高效液相色谱仪中进行，以0-80％乙腈线性梯度进行洗脱，流速为0.7ml/min,收集各洗脱组分，如图1所示，并测定促皮肤修复活性。将图1箭头所示的具有促皮肤修复活性的组分冻干，继续使用rp-hplcc18色谱柱进一步纯化，得到如图2箭头所示的纯化的腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv。

3、腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv的氨基酸测定

纯化的腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv运用edman降解法进行测序，该步骤在美国abi公司的proscise^tm491蛋白质测序仪中进行。测序结果表明腹斑倭蛙皮肤修复肽的全序列一级结构为：argkkeckddrcrllmkrgsfsyv。

二、腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv基因的克隆

1、腹斑倭蛙皮肤总rna提取

活体腹斑倭蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻10小时，取300mg皮肤组织，加入3mltrizol溶液，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为腹斑倭蛙皮肤总rna。

2、腹斑倭蛙皮肤mrna的纯化

mrna分离纯化采用美国promega公司的mrnaisolationsystems试剂盒。

提取的腹斑倭蛙皮肤总rna溶于500μldepc水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl的oligo(dt)探针和13μl20×ssc溶液，混匀后放置室温冷却，称为a液。将磁珠(sa-pmp)轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×ssc0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×ssc悬浮，称之为b液。将a液加入b液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×ssc洗涤4次，最后弃上清，加0.1mldepc水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1depc水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的腹斑倭蛙皮肤mrna。加入1/10体积3m乙酸钠，ph5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μldepc水中。

3、腹斑倭蛙皮肤cdna文库构建

采用clontech公司creator^tmsmart^tmcdnalibraryconstructionkit质粒cdna文库构建试剂盒。

(a)cdna第一链合成(mrna反转录)

在0.5ml无菌的离心管加入1μl腹斑倭蛙皮肤mrna、1μlsmartiv寡聚核苷酸、1μlcdsiii/3’pcr引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15秒，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl5×第一链缓冲、1.0μl20mm二硫苏糖醇、1.0μl10mmdntp混合物、1.0μlpowerscript反转录酶。混合离心管中试剂并以12000rpm离心15秒，在42℃保温1小时。将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cdna第一链备用。

(b)采用长末端聚合酶链式反应(ld-pcr)方法扩增第二链

95℃预热pcr仪，将2μlcdna第一链(mrna反转录)、80μl去离子水、10μl10×advantage2pcr缓冲液、2μl50×dntp混合物、2μl5’pcr引物、2μlcdsiii/3’pcr引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。在pcr仪中按以下程序扩增：95℃，20秒钟；22个循环(95℃，5秒钟；68℃，6分钟)。循环结束后，将离心管中合成的cdna双链进行回收。

(c)pcr产物回收

用promega公司的svgelandpcrclean-upsystem试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

将通过pcr得到的cdna双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使dna充分与硅胶膜结合。12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，以12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复步骤2。12000rpm离心5分钟，将离心纯化柱置于新的离心管中。加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。12000rpm离心30秒，管底溶液即为所纯化过的cdna双链。

(d)大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备

挑取单个dh5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的luria-bertani(lb)培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mllb培养液中，37℃振荡2小时。当od600值达到0.35时，收获细菌培养物。将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10分钟，使培养物冷却至0℃。于4℃以4100rpm离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/lcacl2-mgcl2溶液(80mmol/lmgcl2,20mmol/lcacl2)重悬每份细胞沉淀。于4℃以4100rpm离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置l分钟以使最后的痕量培养液流尽。每50m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1mol/lcacl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

(e)酶切、连接以及连接产物的转化

在微量离心管中加入1μltakarapmd18-t载体、4μl腹斑倭蛙cdna双链溶液，全量为5μl。加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。16℃反应2小时。全量10μl加入100μldh5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入37℃温浴过的lb培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。取200μl涂布于含有x-gal、iptg、amp的lb培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。每个lb平皿用5mllb液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cdna大约含1×10⁶个单独克隆。

4、腹斑倭蛙皮肤修复肽基因克隆筛选

扩增引物序列为5’aagcagtggtatcaacgcagagt3’，pcr另一扩增引物为clontech公司smart^tmcdnalibraryconstructionkit中的3’pcrprimer引物，其序列为5’attctagaggccgaggcggccgacatg3’。pcr反应在如下条件下进行：94℃，30秒钟；52℃，45秒钟；72℃，2分30秒钟，共35个循环。首先滴定构建的细菌cdna文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl),37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有10个样品进行pcr鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

5、腹斑倭蛙皮肤修复肽基因序列测定

提取质粒dna用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国appliedbiosystems373a全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为bcabest^tmsequencingprimerrv-m和bcabest^tmsequencingprimerm13-47，bcabest^tmsequencingprimerrv-m序列：5`gagcggataacaatttcacacagg3’，bcabest^tmsequencingprimerm13-47：5’cgccagggttttcccagtcacgac3’。

基因测序结果表明编码腹斑倭蛙皮肤修复肽前体的基因由652个核苷酸(seqidno:2)组成(genbankaccessionnumber:mh010580)，自5’端至3’端序列为:

其中，第367–438位核苷酸为成熟腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv的编码基因。

三、腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备促皮肤创伤修复治疗药物中的应用

在小鼠背部左右两侧各开等大等圆全皮层创口后，分别给予阴性对照，cathelicidin-nv和表皮细胞生长因子epidermalgrowthfactor(egf)(浓度均为200μg/ml)各20μl，一天两次。在治疗后第0、2、4、6、8、10天，分别拍照创面。

结果如图3所示：在治疗后2天cathelicidin-nv、egf治疗组和阴性对照组相比创口面积分别减小22％、26％。接下来的几天，治疗组创口愈合速度相对于对照组明显加快，到第8天cathelicidin-nv、egf治疗组创口面积比阴性对照组分别减小88％、90％。第8天左右，治疗组创口基本愈合，与对照组相比有显著差异。

实验结果表明：腹斑倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv有较强的促进皮肤创伤愈合的作用，其促进皮肤创伤愈合作用效果与表皮细胞生长因子(egf)相近(详见图3)。

序列表

<110>昆明医科大学

<120>倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv及其基因和应用

<130>2018-02-08

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>prt

<213>nanoranan.ventripunctata

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<212>dna

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