本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法和应用。
背景技术：
干扰素(interferon，ifn)，是由英国科学家isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的一种细胞因子，具有抑制细胞增殖、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。ifn家族包括ifnα、ifnβ和ifnγ三个主要成员，其中干扰素γ(interferongamma，ifnγ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的t细胞和nk细胞产生，在机体免疫系统中发挥重要作用。ifnγ-1b目前用于治疗类风湿性关节炎、肝纤维化、肿瘤等疾病。2000年美国fda批准重组人干扰素γ-1b(rhifnγ-1b，商品名actimmune)上市用于治疗骨硬化症(我国目前尚无用于骨硬化症治疗的药物)。rhifnγ-1b治疗骨硬化症需要长期大剂量用药，临床资料显示，大剂量应用rhifnγ-1b治疗骨硬化症，临床疗效较差，并且副作用明显，产生流感样症状、骨髓抑制等，使患者不能耐受。究其原因，与rhifnγ-1b在体内呈现相对平均的组织分布，未能在骨组织内形成有效的药物浓度有关。
已有研究证实由天冬氨酸或谷氨酸组成的寡肽能够将药物选择性地输送至骨组织，并且在骨组织内长期保留，从而改善治疗效果。其机制在于天冬氨酸或谷氨酸等酸性氨基酸寡肽能够与羟基磷灰石紧密结合，而后者是骨组织的主要成分。基于上述酸性氨基酸寡肽的骨靶向系统，是否能够应用于干扰素，使ifnγ-1b更多富集于骨组织，目前尚不清楚。
另外，目前上市的ifnγ-1b药物为大肠杆菌基因工程产品，含有140个氨基酸，在生产过程中形成包涵体，需要变性、复性等复杂的制备工艺。通常情况下，宿主菌的种类、生长条件和基因重组蛋白的理化性质决定了包涵体是否形成以及表达量的多少。目的蛋白中含硫氨基酸或者脯氨酸含量多，蛋白疏水作用较强，水溶性不好也会引起包涵体的生成。dnastar软件分析结果显示，组成干扰素的140个氨基酸中，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸占44％。大量存在、特别是位于关键位点的疏水性氨基酸是形成包涵体的原因之一。
定点突变技术是通过聚合酶链式反应等方法向目的dna片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、置换等。定点突变能迅速高效地提高dna所表达的目的蛋白的性状及表征，是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具。jonetma等采用定点突变技术构建疏水性显著降低的信号肽，从而促进重组目的蛋白在大肠杆菌的分泌表达。chent等利用定点突变引入大肠杆菌偏爱密码子以促进目的蛋白在大肠杆菌中的表达。lis等采用定点突变技术替代目的蛋白羧肽酶原b中的半胱氨酸，有效减少复性过程中二硫键错配，使得目的蛋白复性率大大增加。本发明利用定点突变原理，基于干扰素蛋白的化学特点和生物学特性，在不改变干扰素γ-1b立体结构的前提下对目的蛋白进行改造，构建骨靶向性rhifnγ-1b突变体，以实现其在大肠杆菌中的可溶性表达。
综上所述，目前ifnγ-1b临床应用存在用药剂量大、副作用明显、患者无法耐受等缺点。究其原因，与该药物在体内呈现相对平均的组织分布有关。而且，ifnγ-1b药物在生产过程中形成包涵体，存在制备工艺复杂、生物活性低等缺点。因此，制备一种能够骨靶向定位并且能够可溶性表达从而具有高活性的干扰素γ-1b，成为本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
为克服上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法。本发明将骨靶向分子与干扰素融合表达，利用骨靶向分子的的骨靶向特性，使干扰素γ-1b在骨组织内富集，从而提高干扰素γ-1b治疗骨组织疾病的特异性，减少用药量，降低毒副作用。同时，本发明基于干扰素γ-1b的生化特点，采用定点突变技术原理，理性设计构建骨靶向性干扰素γ-1b突变体，联合采用大肠杆菌偏爱密码子、表达条件优化等策略，以实现骨靶向性干扰素γ-1b在大肠杆菌中的可溶性表达，从而大大降低生产成本并且大幅度提高干扰素γ-1b生物活性。本发明重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b制备方法简单，具有良好的应用开发前景。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b，其氨基酸序列包括人源干扰素γ-1b及其突变体或其活性片段和骨靶向分子；所述骨靶向分子为针对成骨样干细胞筛选出的多肽适配子，该多肽适配子为含有10个天冬氨酸的寡肽标签。
进一步的，所述人源骨靶向干扰素及其突变体为序列表seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4中的氨基酸序列的全部或部分。
本发明的第二方面，还提供了上述氨基酸序列的dna分子。
在本发明的实施例中，公开了一种编码seqidno.1所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.5所示的核苷酸序列，或与seqidno.5具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；
在本发明的实施例中，公开了一种编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.6具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；
在本发明的实施例中，公开了一种编码seqidno.3所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.7所示的核苷酸序列，或与seqidno.7具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.3所示氨基酸序列的核苷酸序列；
在本发明的实施例中，公开了一种编码seqidno.4所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.8具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.4所示氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的第三个方面，公开了含有编码所述重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其突变体蛋白的dna分子的重组表达载体及重组大肠杆菌。
其中，所述重组表达载体，是将所述dna序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达骨靶向干扰素γ-1b及其突变体的重组表达载体。
所述大肠杆菌表达载体为pet3c质粒。
所述重组大肠杆菌是将所述的重组表达载体转入大肠杆菌中，筛选得到表达骨靶向干扰素γ-1b及其突变体蛋白的大肠杆菌。
本发明的第四个方面，公开了所述的氨基酸序列、dna序列、所述重组表达载体、所述重组大肠杆菌在生产重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b中的应用。
本发明的第五个方面，提供一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b的制备方法，包括如下步骤：
(1)利用定点突变，获得人源骨靶向干扰素γ-1b及其突变体蛋白的目的基因；
(2)构建表达骨靶向干扰素γ-1b及其突变体蛋白的重组表达载体；
(3)将上述重组表达载体导入大肠杆菌，获得人源骨靶向干扰素的重组大肠杆菌菌株，诱导重组大肠杆菌表达，获得重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其突变体蛋白并纯化。
优选的，步骤(1)中，所述干扰素γ-1b及其突变体蛋白的目的基因的核苷酸序列如seqidno.5-8所示；
优选的，所述步骤(2)构建表达干扰素γ-1b及其突变体蛋白的的重组表达载体具体方法为：将步骤(1)中所得人源骨靶向干扰素γ-1b及其突变体蛋白的目的基因以及载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，获得重组表达载体；
进一步优选的，所述载体质粒为pet3c质粒；
进一步优选的，所述限制性内切酶为bamhi和ndei；
优选的，所述步骤(3)中，大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)和大肠杆菌rosetta(de3)，进一步优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)；
优选的，所述步骤(3)中，诱导重组大肠杆菌表达的条件为：诱导表达温度为16-37℃(进一步优选为20℃)，诱导表达时间为3-5h(进一步优选为4h)，诱导剂为iptg，所述iptg的添加终浓度为0.1-1.0mm，进一步优选为0.6mm；
优选的，所述步骤(3)中，使用ni2+亲和层析技术纯化干扰素γ-1b。
本发明的第六个方面，公开了所述重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b在制备治疗骨硬化症药物中的应用。
本发明的有益效果：
目前国内ifnγ主要用于治疗类风湿性关节炎、肝纤维化、肿瘤等疾病。2000年美国fda批准重组人干扰素γ-1b(rhifnγ-1b，商品名actimmune)上市用于治疗骨硬化症。我国目前尚没有药物用于骨硬化症治疗。临床资料表明该药物用于骨硬化症治疗存在费用高、疗效差、副作用明显、患者不能耐受等缺点。其根本原因在于该药物在体内呈现相对平均的组织分布，未能在骨组织内形成有效浓度。本发明在干扰素γ-1b中特别引入具有骨靶向定位功能的适配子即10个天冬氨酸的寡肽标签，成功构建表达了重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b。上述重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b能够有效靶向定位并富集于骨组织，从而提高干扰素γ-1b治疗骨组织疾病的特异性。本发明采用生物合成法将天冬氨酸寡肽核苷酸序列构建到人源干扰素γ-1b及其突变体的核苷酸序列末端，在大肠杆菌内共同转录表达，最终通过纯化得到连接有天冬氨酸十肽的重组人源骨靶向干扰素γ-1b。上述方法与采用化学方法连接天冬氨酸寡肽相比，不仅可简化人源骨靶向干扰素γ-1b的合成工艺，还能有效避免化学合成法连接载体连接率问题带来的损失。
另外，目前应用的重组人干扰素γ-1b为大肠杆菌基因工程产品，在生产过程中形成包涵体，存在制备工艺复杂、生产成本高、生物活性低等缺点。本发明基于干扰素γ-1b的生化特点，在不改变干扰素γ-1b立体构象及生物学活性的前提下，采用定点突变技术原理，改造干扰素γ-1b氨基酸序列中位于关键位点的疏水性氨基酸，理性设计构建骨靶向性干扰素γ-1b突变体，并且联合采用大肠杆菌偏爱密码子、表达条件优化等策略，以实现骨靶向性干扰素γ-1b在大肠杆菌中的可溶性表达，大大降低生产成本。
总之，本发明通过对干扰素γ-1b氨基酸序列进行分子改造，首次同步实现了干扰素γ-1b的骨靶向及可溶性表达功能，表达产物无需变复性等复杂工艺即可获得高纯度目的蛋白，有助于减化制备工艺、降低生产成本。诚然，骨硬化症是一种罕见病，但“罕见病并不罕见”，由于我国人口基数大，许多罕见病在我国也有相当数量的病人存在。骨硬化症的平均发病率为5/100000，据此估算，我国骨硬化症患者约有65万。另外，由于本发明的新型重组人干扰素γ-1b具有骨靶向性，可使药物在骨组织内富集，具有用于骨转移癌的治疗的潜在应用价值。因此，本发明的新型骨靶向性重组人干扰素γ-1b具有广泛的应用前景和积极的社会效益。
附图说明
图1为实施例2骨靶向性干扰素γ-1b及其突变体蛋白的sds-page电泳图。其中，图1：孔道1为蛋白分子量标准，孔道2为空质粒诱导后对照，孔道3和4为pet3c-ifnγ-1b-d10转化菌诱导前、诱导后，孔道5和6为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体1转化菌诱导前、诱导后，孔道7和8为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体2转化菌诱导前、诱导后，孔道9和10为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体3转化菌诱导前、诱导后表达。图中可见在19kd处有单一目的蛋白条带。
图2为实施例3骨靶向性干扰素γ-1b及其突变体蛋白表达形式分析的sds-page电泳图。其中，孔道1为蛋白分子量标准，孔道2和3分别为pet3c-ifnγ-1b-d10转化菌上清和沉淀，孔道4和5分别为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体1转化菌上清和沉淀，孔道6和7分别为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体2转化菌上清和沉淀，孔道8和9分别为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体3转化菌上清和沉淀。图中可见pet3c-ifnγ-1b-d10蛋白突变体1为部分可溶性表达，而pet3c-ifnγ-1b-d10、pet3c-ifnγ-1b-d10蛋白突变体2和pet3c-ifnγ-1b-d10蛋白突变体3为包涵体。
图3为实施例3骨靶向性干扰素γ-1b突变体1表达的时间优化表达图。孔道1为蛋白分子量标准，孔道2-5分别为不同诱导时间后的蛋白表达(2h，4h，6h和8h)。
图4为实施例3骨靶向性干扰素γ-1b突变体1表达的iptg浓度优化表达图。孔道1-4分别为不同浓度iptg诱导后的蛋白表达(iptg浓度依次为0.2mm,0.4mm,0.6mm,0.8mm)，孔道5为蛋白分子量标准。
图5为实施例3骨靶向性干扰素γ-1b突变体1蛋白镍柱纯化后的sds-page电泳图。其中，图5(a)中孔道1为蛋白分子量标准，孔道2为诱导前蛋白表达，孔道3为诱导后蛋白表达，孔道4为镍柱纯化后蛋白表达；图5(b)中孔道1为蛋白分子量标准，孔道2为50mm咪唑洗脱组分，孔道3为500mm咪唑洗脱组分。
图6为实施例3骨靶向性干扰素γ-1b的westernblot检测结果。孔道1为蛋白分子量标准，孔道2为目的蛋白骨靶向性干扰素γ-1b。图中可见在19kd处出现单一特异性条带。
图7为实施例4骨靶向性干扰素γ-1b对小鼠破骨细胞分化能力的影响。其中图7(a)为raw264.7细胞正常分化的破骨细胞；图7(b)为在raw264.7细胞分化过程中加入100μg/ml骨靶向性干扰素γ-1b的破骨细胞。
图8为实施例4骨靶向性干扰素γ-1b的骨靶向性(两种干扰素对羟基磷灰石浓度依赖)的结合曲线图。其中cd10-ifn代表羧基端标记10个天冬氨酸的干扰素γ-1b。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
术语解释
适配子：是指人工合成的单链寡核苷酸(dna或rna)，或者肽链，其能与非核苷酸靶目标物质进行高亲和力、高特异性的结合。
正如背景技术所介绍的，干扰素γ-1b在临床应用中存在疗效不理想，毒副作用大等缺点，其根本原因在于未能在骨组织内形成有效的药物浓度，同时现有技术中的重组干扰素γ-1b易于形成包涵体，造成后续制备工艺步骤繁琐、收率降低。
本发明提供一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法，将骨靶向分子与干扰素γ-1b相融合，利用骨靶向分子的的骨靶向特性，使干扰素γ-1b在骨组织内富集，从而提高干扰素γ-1b治疗骨组织疾病的特异性，减少用药量，降低毒副作用。同时，本发明利用定点突变技术原理替换干扰素γ-1b氨基酸序列中的关键疏水氨基酸，并对密码子、诱导表达条件等进行优化，从而实现了干扰素γ-1b在大肠杆菌中的可溶性表达，大幅度提高了干扰素γ-1b的生物活性，制备方法简单，具有良好的应用开发前景。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个典型实施方式中，提供一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b，其氨基酸序列包括人源干扰素γ-1b或其活性片段和骨靶向分子；所述骨靶向分子为针对成骨样干细胞筛选出的多肽适配子，经实验验证，所述多肽适配子既靶向骨形成表面又靶向骨吸收表面，非常有利于干扰素γ-1b在骨组织内的富集；
本发明的又一典型实施方式中，所述人源骨靶向干扰素γ-1b为序列表seqid.1、seqid.2、seqid.3或seqid.4中的氨基酸序列的全部或部分；
本发明的又一典型实施方式中，提供了上述氨基酸序列的dna分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的干扰素γ-1b的核苷酸序列；对于编码本发明所述重组人源可溶干扰素γ-1b的氨基酸序列的dna分子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构成所设计的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b的氨基酸序列的dna分子；
本发明的又一典型实施方式中，提供了一种编码seqidno.1所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.5所示的核苷酸序列，或与seqidno.5具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；
本发明的又一典型实施方式中，提供一种编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.6具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；
本发明的又一典型实施方式中，提供一种编码seqidno.3所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.7所示的核苷酸序列，或与seqidno.7具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.3所示氨基酸序列的核苷酸序列；
本发明的又一典型实施方式中，提供一种编码seqidno.4所示氨基酸序列的dna分子具有如seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.8具有至少90％的同源性，且能够表达seqidno.4所示氨基酸序列的核苷酸序列；
本发明的又一典型实施方式中，提供了含有编码所述重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其突变体的氨基酸序列的dna分子的重组表达载体及重组大肠杆菌。
其中，所述重组表达载体，是将所述dna序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达干扰素γ-1b及其突变体的重组表达载体。
所述大肠杆菌表达载体为pet3c质粒。
所述重组大肠杆菌是将所述的重组表达载体转入大肠杆菌中，筛选得到表达干扰素γ-1b及其突变体蛋白的大肠杆菌。
本发明的又一典型实施方式中，提供所述的氨基酸序列、dna序列、所述重组表达载体、所述重组大肠杆菌在生产重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b中的应用；
本发明的又一典型实施方式中，提供了所述重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b的制备方法，包括如下步骤：
(1)获得重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b目的基因；
(2)构建表达骨靶向性干扰素γ-1b的重组表达载体；
(3)将重组表达载体导入大肠杆菌，获得人源骨靶向干扰素的重组大肠杆菌菌株，诱导重组大肠杆菌表达，获得重组可溶性人源骨靶向干扰素并纯化。
其中，步骤(1)中，所述干扰素γ-1b目的基因的核苷酸序列如seqidno.5-8所示；
所述步骤(2)构建表达干扰素γ-1b的重组表达载体的具体方法为：将步骤(1)中所得人源骨靶向干扰素γ-1b的目的基因以及载体质粒采用相同的限制性内切酶切割，然后进行连接，转化大肠杆菌，提取质粒，获得重组表达载体；
所述载体质粒为pet3c质粒；
所述限制性内切酶为bamhi和ndei；
所述步骤(3)中，大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)和大肠杆菌rosetta(de3)，进一步优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)；
所述步骤(3)中，诱导重组大肠杆菌表达的条件为：诱导表达温度为16-37℃(进一步优选为20℃)，诱导表达时间为3-5h(优选为4h)，诱导剂为iptg，其添加终浓度为0.1-1.0mm(优选为0.6mm)；
所述步骤(3)中，使用ni2+亲和层析技术纯化干扰素γ-1b。
本发明的又一典型实施方式中，公开了对所述重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b的生物活性分析，包括骨靶向特性和刺激破骨细胞分化能力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1设计骨靶向性重组人干扰素γ-1b(rhifnγ-1b-d10)及其突变体
从genebank、drμgbank数据库中下载人干扰素γ-1b的氨基酸序列及基因序列；dnastar软件分析人干扰素γ-1b的氨基酸序列特点和亲、疏水性等；替换疏水区的关键疏水性氨基酸为亲水氨基酸，同时查询swiss-model网站(https://swissmodel.expasy.org/)，保证氨基酸替代后干扰素的立体构象不发生改变。在人干扰素γ-1b及其突变体蛋白的氨基酸序列羧基端加上10个天冬氨酸标签，作为骨靶向分子。采用大肠杆菌偏爱密码子，引入his标签和相应酶切位点，dnastar软件分析获得骨靶向性干扰素γ-1b及其突变体的基因序列。上述骨靶向性重组人干扰素γ-1b(rhifnγ-1b-d10)及其3种突变体的基因序列委托上海博尚生物公司合成。并构建于pet3c质粒表达载体上，最后保存于dh5α菌株中。骨靶向ifnγ-1b及其突变体基因核苷酸序列见seqidno.5-8。
实施例2重组表达菌的构建
将所构建的4种重组质粒(包括pet3c-ifnγ-1b-d10、pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体1、pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体2、pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体3)以及空质粒分别转化大肠杆菌bl21(de3)、rosetta(de3)。
重组蛋白的诱导表达
(a)分别挑取重组菌的单菌落，接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，200rpm振摇培养过夜；
(b)取上述培养好的菌液30μl接种于3mllb液体培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，200rpm，培养至od600达到0.5～0.6；
(c)向步骤(b)所得菌液中加入终浓度为1.0mmol/l的iptg诱导表达，诱导温度37℃，诱导时间4h；
(d)取步骤(c)得到的培养液于1.5ml离心管中在4℃、12,000rpm条件下离心2min，弃去上清液；
(e)样品中加入40μldh2o悬起沉淀；
(f)各样品中加入2×上样缓冲液40μl，100℃加热5min；
(g)采用sds-page电泳分析重组蛋白的表达，检测结果见图1。(图1：孔道1为蛋白分子量标准，孔道2为空质粒诱导后对照，孔道3和4为pet3c-ifnγ-1b-d10转化菌诱导前、诱导后，孔道5和6为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体1转化菌诱导前、诱导后，孔道7和8为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体2转化菌诱导前、诱导后，孔道9和10为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体3转化菌诱导前、诱导后表达)
实施例3目的蛋白的表达形式分析与纯化
离心收集菌体，按1:20比例重悬于pbs缓冲液中，冰水浴下超声破菌。1g菌体400w功率下超声时间约为5min。12,000rpm离心15min，分别收集上清和沉淀，行sds-page电泳，观察目的蛋白的存在情况。实验结果见图2，孔道1为蛋白分子量标准，孔道2和3分别为pet3c-ifnγ-1b-d10转化菌上清和沉淀，孔道4和5分别为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体1转化菌上清和沉淀，孔道6和7分别为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体2转化菌上清和沉淀，孔道8和9分别为pet3c-ifnγ-1b-d10基因突变体3转化菌上清和沉淀。结果表明ifnγ-1b-d10蛋白主要以包涵体形式表达，ifnγ-1b-d10基因突变体1以部分可溶形式表达。
(1)目的蛋白的诱导表达优化
在确定ifnγ-1b-d10基因突变体1(核苷酸序列seqidno.6)能够可溶性表达后，其可溶性越高，越利于纯化和后续研究。为了优化高效表达条件，在温度、诱导剂剂量、时间等方面进行优化筛选，确定最佳表达条件。具体操作为：
(a)分别取4个含100mllb新鲜培养液(加有amp终浓度为50μg/ml)的250ml锥形瓶，编号1-4，然后分别加入上述重组表达菌液1ml，37℃，200rpm振荡培养；
(b)至菌液od600约为0.6-0.8，对1-4号锥形瓶分别进行条件筛选
i.iptg浓度和诱导时间不变，筛选适宜的诱导表达温度(依次为37℃、30℃、20℃、16℃)；
ii.诱导温度和时间不变，筛选适宜的诱导剂浓度(iptg浓度依次为0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm)；
iii.诱导温度和iptg浓度不变，筛选适宜的诱导时间(依次为2h，4h，6h，8h)；
(c)诱导后离心，4℃，4,000rpm，5min，弃上清。
(d)每100ml培养细胞沉淀，悬于10ml预冷的pbs缓冲液中，超声波进行细胞破碎(400w，每20sec间隔10sec共30次)，破碎后4℃条件下15,000rpm，离心10min。
(e)1-4号样品分别取上清、沉淀，加入10μl的5×样品缓冲液，于100℃加热5min变性，上样前12,000rpm离心5min。
(f)10％sds-page电泳分析，确定可溶性蛋白表达的最佳条件。
通过对不同诱导温度、时间及诱导剂浓度等条件优化，结果于20℃，iptg终浓度0.6mm诱导4h下，破菌后的上清液中ifnγ-1b-d10突变体1可溶性蛋白表达量较高。实验结果见图3和图4；
(g)表达蛋白的大量表达：挑取阳性克隆，接种至含50μg/ml氨苄青霉素的10mllb培养基中，30℃振荡培养过夜至od600＝0.6-0.8，然后按1:100接种至含50μg/ml氨苄青霉素的1llb培养基中，37℃震荡培养至od600＝0.6-0.8。按照前述优化的表达条件进行，即冷却至20℃后，添加iptg至0.6mm，培养4h，然后5,000rpm，离心6min收集菌体，待用。
(2)目的蛋白ifnγ-1b-d10突变体1蛋白的ni2+亲和层析纯化
(a)ni2+亲和树脂的平衡
根据厂商提供的亲和性能指数，1mlni2+树脂可结合8～12mg目的蛋白。通常情况下，100mle.coli可表达目的蛋白1～10mg。所以估算每100mle.coli培养物所需树脂体积为1ml。
轻轻颠倒混匀固化ni2+树脂，吸取1ml树脂装入5ml微量离心管，自然沉降或轻微离心，2,000rpm离心2min，确定柱体积。用3倍柱体积无菌水冲洗。重复6次，小心去除上清。用3倍柱体积结合缓冲液平衡树脂，4℃备用。
(b)制备细胞抽提物
用4ml结合缓冲液悬起100ml表达菌的菌体沉淀，超声裂解或溶菌酶终浓度1mg/ml。5,000rpm离心30min，去除不溶性细胞碎片，将上清转至ni2+树脂管中。
(c)结合、洗涤、洗脱
结合：4℃冰水浴，搅拌至少4h或过夜，留取上清样品1支，行sds-page电泳。洗涤：4倍柱体积的洗涤缓冲液，洗8～10次，以去除杂蛋白，第一次和最后一次洗液留样电泳。洗脱：用6倍柱体积的不同浓度的咪唑洗脱缓冲液洗脱，洗10次，每次洗脱液留样。
(d)sds-page电泳，分析目的蛋白纯化情况及洗脱缓冲液中合适的咪唑浓度。
结果显示蛋白纯度达95％以上。浓度用bradford方法测定，浓度为0.8mg/ml，实验结果见图5；同时采用westernblot对目的蛋白骨靶向性干扰素γ-1b进行检测，实验结果见图6，图中可见在19kd处出现单一特异性条带。
实施例4ifnγ-1b-d10蛋白生物学活性与骨靶向性分析
(1)ifnγ-1b-d10蛋白的促破骨细胞形成活性
将raw264.7细胞培养于α-mem培养基中，添加10％胎牛血清，同时添加两种细胞因子：m-csf和rankl。为了避免细菌污染，向培养基中加入青链霉素溶液。raw264.7细胞是一种鼠源的巨噬细胞系，m-csf和rankl可促进单核-巨噬细胞系向破骨细胞转化，所以一般认为raw264.7是一种前破骨细胞。
以每孔1×105个细胞计数、接种于96孔细胞培养板中，每孔含细胞培养基体积100μl。设空白对照组(培养基)、溶媒对照组(培养基+tbs)、实验组(ifnγ-1b-d10蛋白浓度100μg/ml)。ifnγ-1b-d10蛋白以100μg/ml的终浓度加入每孔，空白对照组加入培养基，每孔总体积200μl，每个浓度设置5孔平行孔。将培养板放入培养箱，在37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养。观察ifnγ-1b-d10蛋白对破骨细胞形态的影响。在rankl的诱导下，raw264.7细胞可以分化为成熟的破骨细胞，此时应用破骨细胞特异性的抗酒石酸酸性磷酸染色(trap染色)，在有成熟破骨细胞的部位可见红色的阳性反应，见图7，对正常组和骨硬化症患者组破骨细胞采用本发明ifnγ-1b-d10蛋白处理，应用破骨细胞特异性的抗酒石酸酸性磷酸染色(trap染色)后其染色密度值见表1。
表1
(2)骨靶向性分析
采用羟基磷灰石吸附法评价骨靶向性ifn蛋白的体外骨靶向性。具体方法是以纳米羟基磷灰石粉末作为吸附介质，使其与一定浓度不同ifn蛋白溶液(c0)(包括普通ifn和骨靶向性干扰素)充分作用，除去吸附介质后用bca法测定出平衡后不同ifn蛋白溶液的浓度(ca)。ifn与羟基磷灰石亲和性的大小通过吸附率进行表征。计算公式为：
吸附率＝(c0-ca)/c0×100％。
将纯化的cd10-ifn和普通ifn与羟基磷灰石悬液混合，终浓度分别为1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml和10.0μg/ml。将上述混合物置于37℃振荡结合90min。0.22μm滤膜过滤或14,000rpm离心10min，将未结合羟基磷灰石的ifn与结合羟基磷灰石的ifn分离。结果显示，羧基端带有10个天冬氨酸作为骨靶向分子的cd10-ifn的羟基磷灰石亲和力是普通ifn的20余倍(见图8)，骨靶向性干扰素在极低浓度下即可结合羟基磷灰石。
本发明受山东省医药卫生科技发展计划项目(2017ws074)和山东省医学科学院院级科技计划面上项目(2017-36)资助。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
sequencelisting
<110>山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所）
<120>一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法
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