本发明属于转基因生物材料中转基因成分的检测技术领域，具体涉及用于mstn基因敲除猪鉴定的功能核酸快速pcr方法与试剂盒。
背景技术：
随着转基因新品种的不断形成，转入外源基因的转基因生物一直受到社会质疑，使得转基因生物的推广工作困难重重。为了消除消费者对外源基因抵触的心理，目前转基因生物的研制方向已转向内源基因敲除的研究，基因敲除是通过使目的基因失活，从而实现对基因组的精确修饰。而对基因敲除动物进行鉴定并建立便捷的检测方法是当前的趋势。
mstn(myostatin)基因(genbank登录号：nm_214435)即肌肉生长抑制素基因，也叫生长分化因子(growthdifferentiationfactor8)基因，能够通过调控成肌细胞进而抑制肌肉生长。动物mstn基因的缺失或者失活可以正向调控肌细胞数量、肌纤维的直径和数量，表现为双肌性状(marraffinila,sontheimerej.crisprinterferencelimitshorizontalgenetransferinstaphy-lococcibytargetingdna[j].science,2008,322(5909):1843-1845.)。而利用基因编辑技术对猪的mstn基因进行敲除，有益于提高猪的生长速度和瘦肉率，对养猪业的发展具有重要的研究意义和应用前景。而功能核酸是用来检测的核酸分子。
目前针对基因敲除生物的检测方法有t7eⅰ核酸内切酶法、surveyor核酸内切酶法以及dna测序法。t7eⅰ和surveyor核酸内切酶法能够检测出基因敲除生物全基因组存在的脱靶位点，但是对于基因敲除结果的检测效率不高，特别是对于单个或者少数碱基发生敲除的情况不能有效的检出。dna测序方法在基因敲除检测中是首选方法，也是公认的金标准方法，但是实验成本高。因此，如何有效、准确、快速地检测出是否为基因敲除动物，并建立一种简单易行的检测方法已经成为目前的研究焦点。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测mstn基因(genbank登录号：nm_214435)敲除猪的pcr引物与试剂盒。
本发明根据基因敲除位点设计特异引物，针对不同的等位基因扩增出不同的特异性片段，从而实现对mstn基因敲除猪的检测与鉴定。所述的pcr引物分别如seqidno:3、seqidno:4所示(扩增的片如seqidno:1所示)，以及seqidno:4和seqidno:5(扩增的片段如seqidno:2所示)。
本发明的试剂盒包括mstn基因敲除猪的pcr引物、反应试剂以及阳性对照dna模板、阴性对照dna模板和双蒸水。利用pcr扩增，可判定是否是mstn基因敲除猪，野生型猪或mstn基因敲除杂合型猪。
本发明的试剂盒还可用于猪mstn基因分型方面。
具体地，本发明采用以下技术方案：
本发明首先根据基因敲除位点，设计2条不同的正向引物和一条共用的反向引物；所述的其中一条正向引物是针对野生型检测设计的，其3′端终止于对应的敲除位点ag碱基处，并且在5′端添加20bp功能核酸接头设计(gcttatctatagcattgaag)；所述另一条正向引物是针对敲除型检测设计的，该引物的3′端跨越敲除位点ag碱基后再延伸到ct碱基；进而达到通过pcr扩增，实现对基因敲除猪及基因型快速简便的检测。
本发明的创造性在于：通过一次pcr就能对三种基因型的样品进行鉴定，并且引物设计也与常规pcr引物设计不同，由于样品是少数碱基(即ag二个碱基)的敲除，通过常规的pcr引物的扩增，电泳后不能有效对mstn基因敲除杂合型猪进行区分。所以申请人在设计引物时首先在mstn-w-f的5′端添加了一段20bp的功能核酸序列，在mstn-w-f和mstn-ko-f的3′末端也进行了创新，mstn-w-f的3′端终止于敲除碱基ag上，而mstn-ko-f跨过敲除碱基ag向下延伸了两个碱基ct，同时mstn-w-f和mstn-ko-f共用一条反向引物，在pcr扩增时把三条引物同时加到同一个pcr反应体系中进行扩增。由于不同基因型的待测样品，不同的引物起的作用不同，这样使有两个碱基区别的样品也能通过普通pcr扩增，再通过普通电泳可以很明显地将条带区分开来。
本发明中检测结果可采用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可通过测序或其他有效方法检测。其中，提取样品基因组dna的方法可参考常规苯酚-氯仿提取法。
本发明组装的试剂盒可以快速鉴定样品中是否含有mstn基因敲除型猪和野生型(非转基因)猪成分，此外本发明的引物组合还可对猪的基因型进行分型鉴定。
本发明的方法可以用于转基因动物检测、转基因成分的鉴定。本发明组装的试剂盒可用于快速、特异地检测转基因动物、转基因成分的鉴定和非转基因材料的筛查。
附图说明
seqidno:1是野生型待检样品扩增片段的核苷酸序列。序列长度为290bp；
seqidno:2是基因敲除型待检样品扩增片段的核苷酸序列。序列长度为268bp；
seqidno:3是本发明检测方法和试剂盒中的引物对的正向引物mstn-wt-f的序列。
seqidno:4是本发明检测方法和试剂盒中引物对的反向引物mstn-r的序列。
seqidno:5是本发明检测方法和试剂盒中另一个引物对的正向引物mstn-ko-f的序列。
图1：本发明的方法在不同类型待检样品中的检测结果。附图标记说明：图1分别以野生型猪基因组dna、mstn基因敲除纯合型猪基因组dna和mstn基因敲除杂合型猪基因组dna为模板分别进行pcr扩增的结果。当模板为野生型猪基因组dna时只能扩增出一条带(290bp)；当模板为mstn基因敲除型(纯合型)猪基因组dna时也只能扩增出一条带(268bp)，而且该条带要比野生型为模板的样品的条带要小22bp；当模板为mstn基因敲除型(杂合型)猪基因组dna时可扩增出两条带，分别为290bp和268bp，且这两条带的大小分别与野生型和纯合型的条带相同。泳道中编号说明如下：m：markerⅰ；1：空白对照；2：野生型猪；3：mstn基因敲除纯合型猪；4：mstn基因敲除杂合型猪。
具体实施方式
实施例1mstn基因敲除猪检测方法的引物设计
申请人提供了一种检测mstn基因敲除猪成分的pcr引物设计方法，根据敲除位点设计2条不同的正向引物(seqidno:3，即正向引物1和seqidno:5，即正向引物2)和共用的一条反向引物(即seqidno:4)。上述正向引物中有一条是用于检测野生的引物，其正向引物的序列如seqidno:3所示，该引物的3′端终止于对应的敲除位点(seqidno:3的42和43ag两个碱基处)；所述的另一条正向引物是针对敲除型检测设计的，该正向引物的序列如seqidno:5所示，该引物的3′端跨越敲除位点(即，seqidno:3序列的42和43ag两个碱基处)后再进行延伸两个碱基(即seqidno:5的22和23ct两个碱基处)。申请人在针对野生型猪检测的正向引物的5′端进行功能核酸接头设计，即添加20bp的随机序列(gcttatctatagcattgaag)，以便使野生型猪和敲除型猪的扩增片段大小存在差异，达到通过pcr扩增，使mstn基因敲除猪、野生型猪及mstn基因敲杂合子猪能扩增出不同大小片段，实现对基因敲除猪快速简便的检测。
申请人提供了一种mstn基因敲除猪的pcr引物，该引物的核苷酸序列如下所示：
正向引物mstn-wt-f：5′-gcttatctatagcattgaagccctctaactgtggattttgaag-3′；
正向引物mstn-ko-f：5′-ccctctaactgtggattttgact-3′；
反向引物mstn-r：5′-cacccacagcgatctactacca-3′；
上述检测mstn基因敲除猪的pcr引物长度一般为22～43bp，引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。
上述引物可特异性地对mstn基因敲除猪、野生型猪及其猪的基因分型进行鉴定。
为了使用方便，可以将上述引物和相关试剂组装成方便适用的试剂盒。所述的试剂盒按照如下配置进行组装：
(1)pcr引物
正向引物mstn-wt-f：5′-gcttatctatagcattgaagccctctaactgtggattttgaag-3′；
正向引物mstn-ko-f：5′-ccctctaactgtggattttgact-3′；
反向引物mstn-r：5′-cacccacagcgatctactacca-3′；
(2)相关试剂
10×pcrbuffe、dntpmix、taq聚合酶、阳性对照dna模板、阴性对照dna模板、双蒸水(空白对照)。
阳性对照dna模板为mstn基因敲除猪纯合型基因组dna，阴性对照dna模板为野生型猪(即非转基因猪)基因组dna；
本发明的引物和试剂盒可在mstn基因敲除猪、野生型猪和基因分型中应用。
申请人提供了一种适用于mstn基因敲除猪的pcr检测方法，其包括如下步骤：
(1)按常规方法提取猪基因组dna；
(2)用正向引物mstn-wt-f(seqidno:3)，正向引物mstn-ko-f(seqidno:5)和反向引物mstn-r(seqidno:4)对mstn基因进行pcr扩增，以mstn基因敲除纯合型猪dna模板为阳性对照，以野生型(非转基因)猪dna模板为阴性对照，以双蒸水为空白对照。
(3)检测pcr扩增产物和结果判定。
pcr扩增的反应体系如表1。
表1pcr扩增的反应体系
pcr反应程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环；72℃终延伸5min，4℃降温2min。
结果判定：当pcr反应产物含有且只有一条扩增片段(268bp)且与阳性对照扩增片段大小相同，而空白对照无扩增产物时，可判定样品中检测出mstn基因敲除猪成分，确定该基因型为纯合型。当pcr反应产物中含有且只有一条扩增片段(290bp)且与阴性对照扩增片段大小相同，而空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出mstn基因敲除猪成分，确定该基因型为野生型(即非转基因)。当pcr反应产物中含有两条扩增片段(即，268bp和290bp)，且两条扩增片段的大小分别与阳性对照和阴性对照扩增片段大小相同，而空白对照无扩增产物时，则判定样品中检测出mstn基因敲除猪成分，其基因型为敲除杂合型。如果阳性或阴性样品中未检测出预期片段，说明试剂盒中试剂失效或操作方法失误。若空白对照与阳性样品或阴性样品均检测出预期片段，说明试剂盒的试剂污染或操作方法失误。
实施例2mstn基因敲除猪检测方法在不同类型样品中的检测。
一、试样的制备与保存
1、取样
采集猪(梅山猪，为常规品种)耳样样品，于-20℃下保存备用。
dna模板制备：
dna模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克j,弗里奇ef,曼尼阿蒂斯t.分子克隆实验指南[m].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京，科学出版社,1999，465-467)或者公认的、具有相同效力的其他常用提取方法。
二、引物设计
本实施例的引物序列如表2所示。
表2实施例1的pcr扩增引物
预期可得到扩增片段大小：野生型猪模板的扩增片段大小为290bp，mstn基因敲除型的纯合型猪模板的扩增片段为268bp，mstn基因敲除型的杂合型模板猪扩增片段为两条大小片段，分别为290bp和268bp。
试验表明，本发明的方法及其引物组合特异性强，在不同类型的模板中能特异性地扩增出预期的目的片段，且灵敏度较高。从经济型和综合效果来评价，以表2中的引物组合为最佳引物组合。
三、pcr检测
(1)试样pcr反应
1)在pcr反应管中依次加入反应试剂(见表1)，混匀，再加25μl石蜡油(有热盖设备的pcr仪可不加)。
2)将pcr管在离心机上500g～3000g离心10s，然后取出pcr管，放入pcr仪中。
3)进行pcr反应。程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃终延伸5min，4℃降温2min。
4)反应结束后取出pcr管，对pcr反应产物进行电泳检测。
(2)对照pcr反应
1)在试样pcr反应的同时，设置空白对照、阴性对照及阳性对照。各对照pcr反应体系中，除模板外其余组分及pcr反应条件与(1)相同，且阴性、阳性对照dna模板浓度也应达到试样dna模板浓度要求。
2)以野生型猪基因组dna作为pcr反应体系的阴性对照模板。
3)以mstn基因敲除纯合型猪dna作为pcr反应体系的阳性对照模板。
4)以双蒸水作为pcr反应体系的空白对照模板。
四.pcr扩增产物的检测及结果判定
按25g/l的质量浓度称取琼脂糖，加入1×tae缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100ml琼脂糖溶液中加入5μl溴化乙锭(eb)溶液，混匀，稍微冷却后，倒入电泳板上，插上梳板，在室温下凝固成凝胶后，置于1×tae缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取3μlpcr产物与1μl加样缓冲液(配制方法：称取250.0mg溴酚蓝，加入10ml水，在室温下溶解1h；称取250.0mg二甲苯腈蓝ff，加10ml水溶解；称取50.0g蔗糖，加30ml水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100ml，于4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入dna分子量标准，接通电源在2v/cm～5v/cm条件下电泳2～3h后检测。
电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据dna分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
五、结果分析与表述
1、对照检测结果分析
阳性对照的pcr反应中，样品得到扩增，且扩增片段为268bp，而阴性对照中扩增出290bp的条带，空白对照中除引物二聚体外没有任何扩增片段，表明pcr扩增体系正常工作。否则，重新检测。
2、样品检测结果分析和表述
(1)若样品有且只有一条扩增片段且扩增片段大小为268bp，表明样品中检测出mstn基因敲除成分，经基因型分型测定为敲除纯合型。
(2)若样品有两条扩增片段且扩增片段大小为268bp和290bp，表明样品中检测出mstn基因敲除猪成分，经基因型分型中测定为敲除杂合型。
(3)若样品有且只有一条扩增片段且扩增片段大小为290bp，表明样品中未检测mstn基因敲除成分，经基因型分型中测定为野生型。
(4)若样品没有扩增片段，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出mstn基因敲除成分。
实施例3试剂盒的组装
试剂盒的组装：
正向引物mstn-wt-f(seqidno:3)；mstn-ko-f(seqidno:4)；
反向引物mstn-r(seqidno:5)；
10×pcrbuffer；
dntpmix；
taqdna聚合酶；
阳性对照dna模板(mstn基因敲除纯合型猪dna模板)；
阴性对照dna模板(野生型猪dna模板)；
双蒸水。
本试剂盒的有效期在-20℃储存12个月，不影响使用效果。
试剂盒的应用方法：
依据以下的pcr反应体系加样，于200μl的ep管，见表3。
表3实施例2的pcr反应体系
10×pcrbuffer、dntpmix和taqdna聚合酶购自takapa。10×pcrbuffer是将是将pcr反应所需的mgcl2以及反应缓冲液预先配置成10倍浓度的混合物。
2.依据实施例1的pcr扩增条件上样
3.反应结束后取3μlpcr扩增产物，2.50％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2v/cm～5v/cm，电泳2～3h)，用溴化乙锭(eb)染色，凝胶成像系统检测结果。
每个反应需设置空白对照、阳性对照和阴性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
序列表
<110>华中农业大学
<120>用于mstn基因敲除猪鉴定的功能核酸快速pcr方法与试剂盒
<141>2018-05-04
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>290
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(290)
<400>1
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attattgcacccaaaagatataaggccaattactgctctggagagtgtgaatttgtattt120
ttacaaaaataccctcacactcatcttgtgcaccaagcaaaccccagaggttcagcaggc180
ccctgctgtactcccacaaagatgtctccaatcaatatgctatattttaatggcaaagaa240
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