本发明涉及一种基于微孔板的肌醇定量检测方法，尤其是一种基于微孔板培养的高通量检测食品中肌醇含量的方法，属于微生物检测领域。
背景技术：
：肌醇是含有6个碳的环多醇，医学界将其划分在维生素类，称为维生素b8。肌醇及其衍生物和肌醇化合物存在于所有动物组织，在心脏和大脑中含量最高。目前肌醇被广泛应用于医药工业、食品、饲料和日用化工等领域。大量实验表明肌醇是一种必需的营养因子，人类和动物体内的肌醇可自身合成，但大多是来自于食物。对食品中肌醇含量的检测已经成为食品检测的一个重要指标。肌醇定量分析方法主要有经典的质量法、高碘酸钠法、高效液相色谱法、气相色谱法和微生物法。质量法使用大量的三氯甲烷等对人体有害的物质，并且无法排除葡萄糖的影响；高碘酸钠法仅适用于肌醇为主要成分的样品测定，复杂样品中葡萄糖和甘油等于肌醇结构类似或者官能团类似的有机成分会对测定结果影响很大；高效液相色谱法和气相色谱法不仅需要昂贵的测定仪器、特定的色谱柱，还要通过繁杂的衍生化等技术，成本较高、操作较繁琐；微生物法，利用葡萄汁酵母菌(atcc-9080)对肌醇的特异性和灵敏性，定量测定出食品中肌醇的含量。与上述其它方法相比，微生物法具有快速、简便、检出限低、灵敏度高等优点，是食品安全国家标准(食品中肌醇的测定gb5009.270—2016)中的两个推荐检测方法之一。现有的微生法测定肌醇方法主要包括以下步骤：1、接种斜面保存的菌种至新的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上并培养，得到复苏菌种；2、将复苏菌种转接到麦芽浸粉培养基上，于规定的温度下培养16-24h；3、利用接种环刮取菌苔于装有生理盐水的无菌离心管中，进行离心、清洗，如此清洗3-4次，吸取一定量的该菌液移入装有10ml生理盐水溶液中得到接种菌悬液，利用分光光度计，以生理盐水作空白，控制该菌液的在550nm下的透光率在60％～80％；4、最后取接种菌悬液接种至含有肌醇测定培养基和肌醇标准工作液或待测样品的培养管中(培养液总体积为10ml)，培养22-24h，取培养细胞悬浮液，稀释后测定吸光度，从而获得肌醇标准曲线并计算待测样品中肌醇含量。现有微生物检测方法存在以下问题：1、肌醇测定培养基的消耗很大，检测成本较高。每支培养管中肌醇测定培养基的添加量均为5ml(成本约2元)，在检测过程中，标准曲线测定需要10支培养管，每支需要消耗5ml肌醇测定培养基(成本约20元)；每个待测样品国标中要求稀释3个浓度，每个浓度做3个平行，单个样品检测需要消耗45ml肌醇测定培养基(样品检测成本约18元)。2、培养之后的检测步骤繁琐，所需时间较长。现有的肌醇检测过程分为两个阶段：试管培养阶段和分光光度计检测阶段。培养阶段在培养管中进行，培养结束以后无法直接测定，需将试管中的培养菌液稀释后，置于比色皿中逐个对样品进行测定，样品检测过程繁琐，时间长。3、检验所用的是酵母细胞，酵母细胞个体较大，极易发生沉降，菌液吸光度检测步骤时间过长，容易影响检验结果的准确性和重复性。4、此外，由于检测步骤较繁琐，工作强度大，难以实现对大量样品的高通量检测。为解决上述问题，需要开发一种操作简单、快速、成本低且容易实现高通量检测的新方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用微孔板检测肌醇含量的方法，其具有容易操作、检测时间短、成本低、高通量的特点。本发明所述方法包括以下步骤：步骤a：复苏肌醇检测用菌。肌醇检测用菌可以使用葡萄汁酵母菌atcc-9080，或者粟酒裂殖酵母、耐温絮凝酵母等具有肌醇营养缺陷型的菌株；优选葡萄汁酵母菌atcc-9080；步骤b：制备接种菌基液：将复苏得到的检测用菌以无菌盐水多次洗涤后，加入到无菌盐水中，制成菌基液；步骤c：吸取适量的菌基液利用0.9％的无菌盐水进行稀释得到菌悬液，以无菌盐水作空白，使用分光光度计测定600nm波长下所述菌悬液的吸光值，控制菌悬液吸光值在0.1～0.3之间，即为接种菌悬液；步骤d：将肌醇标准溶液或待检测的样品溶液加入微孔板中，再补充肌醇测定培养基；步骤e：取步骤c中的接种菌悬液接种至步骤d中的微孔板(96孔微孔板)中，微孔板置于1200～1350r/min的高速震荡摇床中，于30±1℃震荡培养14～17h；利用高速震荡摇床对微孔板进行震荡培养，可防止酵母细胞发生沉降，酵母细胞能够均匀分散于培养液中，利于后期利用酶标仪检测菌体浓度，缩短检测培养时间；步骤f：对于在步骤d添加了肌醇标准溶液的微孔板，经步骤e的震荡培养后，利用酶标仪于600nm处测定吸光值，并以吸光值为纵坐标，以肌醇含量为横坐标绘制标准曲线；对于在步骤d添加了待检测样品溶液的微孔板，经步骤e的震荡培养后，利用酶标仪于600nm处测定吸光值，根据标准曲线，计算样品中的肌醇含量。在本发明的一种实施方式中，步骤e中单个微孔中的装样体积为150μl～300μl，优选200μl。在本发明的一种实施方式中，步骤e中单个微孔中接入的菌悬液的体积是3μl～10μl，优选5μl。具体地，微孔板形式的微生物法定量检测肌醇的方法，包括以下步骤。步骤a：将斜面保存的葡萄汁酵母菌atcc-9080接种至新的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上并培养得到复苏菌种；步骤b：制备接种菌基液；将步骤a的复苏菌种利用0.9％的无菌盐水洗下，离心收集细胞，再用0.9％的无菌盐水重新悬浮细胞，再次收集菌体，重复清洗2-3次，再加入10ml无菌盐水，震荡混匀制备成菌基液；步骤c：选取适量的菌基液利用0.9％的无菌盐水进行稀释，用分光光度计，以无菌盐水作空白，600nm波长下测定该菌悬液的吸光值，控制菌悬液吸光值在0.1～0.3之间，即为接种菌悬液；步骤d：将肌醇标准溶液或者待检测的样品溶液加入微孔板中，补充肌醇测定培养基；步骤e：取步骤b中的接种菌悬液接种至微孔板中，微孔板置于高速震荡摇床，1350r/min，30±1℃震荡培养14～17h；步骤f：利用酶标仪于600nm处测定微孔板中含有肌醇标准溶液的微孔的吸光值，并以吸光值为纵坐标，以肌醇含量为横坐标绘制标准曲线；以相同波长测定添加待检测样品溶液微孔的吸光值，根据标准曲线，计算样品中的肌醇含量。本发明利用微孔板法培养葡萄汁酵母菌atcc-9080用于检测食品中肌醇含量。与国标中采用试管培养测定肌醇含量方法相比，本发明提供的方法中肌醇测定培养基的使用量仅为国标方法的1/50，可以显著减少测定培养基的使用，可以极大的降低肌醇测定培养基的使用成本；同时利用微孔板在高速震荡摇床进行培养，使用酶标仪对最终结果进行检测，避免了试管转到比色皿繁琐的操作，减少了由于酵母沉降对测定结果的影响，提高了检测结果的准确性和可重复性；并且整个检测时间短，本发明中只需震荡培养14-17h，而国标中需要培养22-24h，培养时间下降超过1/4；国标中检测需要利用试管进行菌株培养，劳动强度大，操作繁琐，难以实现高通量的检测，本发明采用微孔板进行培养和检测，成本低，操作简单，单个96孔微孔板即可实现多个样品的快速检测，易于实现高通量检测。本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：通过本发明的测定方法绘制的标准曲线相关系数与国标现有检测方法接近，并且检测过程大大降低了成本和检验过程的繁琐程度，缩短了检测时间，增加了检测结果的准确性和可重复性，同时可以高通量的对样品进行检测。附图说明图1微孔板法肌醇测定流程示意图。图2不同装样体积肌醇测定标准曲线图(a：装样体积150μl，b：装样体积200μl，c装样体积300μl)。图3不同接种量肌醇测定标准曲线图(a：接种量3μl，b：接种量5μl，c：接种量10μl)。图4国标gb5009.270-2016中肌醇微生物检测法肌醇测定标准曲线图。图5样品检测中肌醇测定标准曲线图。具体实施方式以下实施例以微孔板形式的微生物法定量检测标准溶液中的肌醇，测定标准曲线，结合附图对本发明作进一步说明。实施例1参考图1，利用微生物对标准溶液中肌醇含量的进行检测的方法，包括以下步骤。步骤a：复苏肌醇接种菌至斜面，得到复苏菌种所述肌醇接种菌为葡萄汁酵母菌(atcc-9080)，将葡萄汁酵母菌活化后接种到麦芽浸粉琼脂斜面培养基上，30±1℃下培养24h，再转接2-3代后得到复苏菌种，麦芽浸粉琼脂斜面培养基配方：麦芽浸粉30g，大豆蛋白胨3g，琼脂粉15g，加水至1l，121℃灭菌20min，ph调至5.6±0.2；步骤b：制备接种菌基液：将步骤a的复苏菌种转接至麦芽浸粉琼脂培养基上，30±1℃培养24h，利用10ml的0.9％的无菌生理盐水洗下菌体，转移至无菌离心管中，3000r/min离心5min，去掉上清液，再加入10ml的0.9％的无菌生理盐水，进行清洗。再次3000r/min离心5min，去掉上清液，重复清洗2-3次，再加入10ml的无菌盐水，震荡混匀即为菌基液；步骤c：选取适量的菌基液利用0.9％的无菌盐水进行稀释，用分光光度计，以无菌盐水作空白，600nm波长下测定该菌悬液的吸光值，控制菌悬液吸光值在0.1～0.3之间，得到接种菌悬液。肌醇测定培养基的成分及制备方法参见食品安全国家标准gb5009.270-2016《食品中肌醇的测定》。步骤d：利用接种菌悬液，制作标准曲线步骤d1：准备新的微孔板，设置总装样体积为150μl，200μl，300μl三个对照试验，以微孔板的一列为1组，每组有8个浓度梯度，每个装样体积设置3个对照组。分别按照表1，表2，表3向每个标准微孔板中加入不同体积的无菌水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基。表1装样体积150μl微孔板加入的无菌水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基表2装样体积200μl微孔板加入的无菌水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基表3装样体积300μl微孔板加入的无菌水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基步骤d2：向每个标准培养微孔中加入10μl接种菌悬液接种，在高速震荡摇床上进行震荡培养，1350r/min，30±1℃震荡培养14h。步骤d3：利用酶标仪测定标准组内微孔中菌液的吸光度，不同装样体积的测定结果见表4(3个对照组的平均值)，以肌醇标准工作液的肌醇含量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，标准曲线见图2，标准曲线的相关系数见表4。表4不同装样体积的微孔吸光值及标准曲线相关系数本实施例在于研究本发明中，微孔板不同装样体积对于本发明检测结果的可靠性的影响，通过标准曲线的相关系数反映出，装样体积为200μl时，标准曲线的线性化最好。实施例2本实施例的检测方法与实施例1区别在于：步骤d1、按照表2向每个标准微孔板中加入不同体积的无菌水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基，总体积为200μl。步骤d2、向每个标准培养微孔中加入接种菌悬液接种，设置接种体积3μl、5μl、10μl三个不同接种量接种。步骤d3、不同接种量的测定结果见表5，制作的标准曲线见图3。表5不同接种量的微孔吸光值及标准曲线相关系数本实施例在于研究本发明中，微孔板在确定相同的装样体积，不同的接种量对于本发明检测结果的可靠性的影响。通过标准曲线的相关系数反映出，在装样体积确定200μl时，接种量为5μl时标准曲线的线性化最好。为检验检测时间对于本发明的检测结果的影响，在检测接种量对于本发明检测结果的影响，同时进行以下操作。选择接种量5μl的样品在震荡培养12h、14h、18h时利用酶标仪检测微孔中菌液的吸光值，制作出不同培养时间的标准曲线，其相关系数见表6。在12h观察可以发现，微孔板中酵母的生长情况较差，故不进行检测，对18h后的吸光值进行检测，吸光值都高于1，超出检测酶标仪检测范围，且在24h后进行检测，吸光值不再增长，达到生长上限。表6接种量5μl不同培养时间制作的标准曲线的相关系数检测时间(h)标准曲线的相关系数120.9127140.9765180.9096对比例本对比例的检测方法参考食品安全国家标准gb5009.270-2016《食品中肌醇的测定》中微生物法，制作的标准曲线见图4。图4中的标准曲线的相关系数低于微孔板检测最终标准曲线的相关系数，与微孔板检测未进行优化的标准曲线的相关系数接近，证明本发明的检测方法的可靠性。本发明检测中所使用的肌醇测定培养基只为国标方法中的1/50，检测时间为国标中的1/4，本发明中利用酶标仪对结果进行检测，降低了检测过程的繁琐程度，同时去除了因为酵母细胞在检测过程中因为沉降而造成检测结果重复性差，准确性低的影响，从而大大提高检测结果的可靠性。实施例3为检测本发明对样品检测结果的可靠性，本实施例对脱脂奶粉中肌醇含量进行检测。本实施例与实施例1的区别在于：步骤d1、按照表2向每个标准微孔板中加入不同体积的无菌水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基(总体积为200μl)。步骤d2、向每个标准培养微孔中加入5μl接种菌悬液接种，在高速震荡摇床上进行培养，30℃培养14h。步骤d3、制作的标准曲线见图5。步骤e、将样品处理成待测液，并测定待测液的吸光度称取1份脱脂奶粉，质量为2.1254g，将样品经盐酸溶解、消化、ph值调节、定容、过滤后制得待测液。调整稀释度，使待测液肌醇的浓度在0.1μg/ml～1μg/ml范围内。表7不同测试组微孔中加入的蒸馏水、待测液和肌醇测定培养基样品编号样品a样品b样品c样品d样品e样品f样品g样品h待测液(μl)10080605040302010无菌水(μl)020405060708090测定培养基(μl)100100100100100100100100样品设置两个平行对照组，按表7向每个微孔中加入不同体积的无菌水、待测液和肌醇测定培养基，分别标记为样品a、样品b、样品c、样品d、样品e、样品f、样品g、样品h，每个测试组的微孔中加入5μl接种菌悬液接种，培养后，通过酶标仪测定待测液的吸光度，结果见表8。样品：m＝2.1254g表8待测液的吸光度及样品肌醇含量步骤f、计算样品中肌醇的含量根据表8中待测液的吸光度，从图5所示的标准曲线中查得待测液中肌醇的质量，根据稀释因子和称样量计算出每个测试微孔中样品中肌醇的含量，结果见表8，在通过平均值计算出样品的肌醇含量为47.09mg/100g，计算方法参考食品安全国家标准gb5009.270-2016《食品中肌醇的测定》。为进一步检验本发明对食品中肌醇含量检测的可靠性，在检验样品肌醇含量的同时进行以下操作步骤，通过加标回收率验证标准曲线的准确度。加标回收率检验的具体步骤：称取样品(脱脂奶粉)，加标样品的质量为2.1222g，加入0.4mg肌醇，经盐酸溶解、消化、ph值调节、定容过滤后制得加标待测液。调整稀释度，使待测液肌醇的浓度在0.1μg/ml～1μg/ml范围内。表9不同加标组微孔中加入的蒸馏水、待测液和肌醇测定培养基样品设置两个平行对照组，按表9向每个微孔中加入不同体积的无菌水、待测液和肌醇测定培养基，分别标记为加标样品a、加标样品b、加标样品c、加标样品d、加标样品e、加标样品f、加标样品g、加标样品h，每个测试组的微孔中加入5μl接种菌悬液接种，培养后，通过酶标仪测定待测液的吸光度，结果见表10。加标样品m＝2.1222g表10加标待测液的吸光度及加标样品肌醇含量根据表10中加标待测液的吸光度，从图5所示的标准曲线中查得加标待测液中肌醇的质量，根据稀释因子和称样量计算出每个测试组培养管中样品加标后的肌醇含量，结果见表10，再通过平均值计算出样品加标后的肌醇含量为，计算方法参考食品安全国家标准gb5009.270-2016《食品中肌醇的测定》。表11微孔板样品检测数据可靠性的综合评价根据样品在加标前后的肌醇含量及样品中加入的肌醇量来计算加标回收率，计算方法为如下：样品加标量＝加标量/样品质量加标回收率＝(加标样品含量-样品含量)/(样品加标量×100)×100％其中：加标量——加标回收率检验中加入的肌醇量，0.4mg。样品质量——加标回收率检验中称取样品的质量。加标样品含量——加标样品的肌醇含量63.92mg/100g。样品含量——样品中的肌醇含量47.09mg/100g。计算得出加标回收率为90.2％。本实施例通过相对偏差，重复性偏差及加标回收率对检测数据的可靠性进行综评价，见表11。由表11可见，利用微孔板法对样品的肌醇含量进行检测，检测的加标回收率符合标准要求，样品及加标样品测定的重复性偏差低，符合精密度<10％的要求，无样品及加标样品的肌醇含量数据>15％，数据可靠性高，测定结果准确。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12