本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化
技术领域：
，具体涉及一种提取柠檬苦素和诺米林的方法。
背景技术：
：柠檬苦素(limonin)与诺米林(nomilin)是柑橘中主要的柠檬苦素类化合物，其是三萜类植物的次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科植物中，尤其在柑橘属的种子中含量较高。柑橘核中的柠檬苦素类化合物主要包括柠檬苦素类化合物甙元和糖苷，其中甙元类物质主要有柠檬苦素、诺米林、黄柏酮、异黄柏酮酸等，糖苷类物质一般为d环开环加入一个糖基。柠檬苦素，别名：黄柏内酯、吴茱萸内酯，分子式c26h30o8,分子量470.53，纯品为白色、味苦、结晶状；诺米林，分子式c28h34o9，分子量514.57，白色粉末，味苦。随着柠檬苦素类化合物结构的确定及其生物学功能的阐明，柑橘果实中柠檬苦素类化合物的开发利用呈现出广阔的市场前景。以前人们对柠檬苦素类化合物的认识是为了将其从柑橘果实中除去，以提高柑橘果汁的商品价值。随后研究发现柠檬苦素类化合物在促进癌细胞凋亡、抗菌、抗病毒、抗疟疾、抗炎和昆虫拒食等方面具有重要生物活性。目前，人们对柠檬苦素类化合物的需求量日益增加，国内外对柠檬苦素类似物的大规模提取分离以及作为功能性食品添加剂的应用研究已经开始；而且可以预测，在不远的将来柠檬苦素类化合物将有更广阔的应用前景。目前，柠檬苦素类化合物的提取分离工艺存在有机溶剂用量大、产率低、纯度不高及提取成本高的问题。中国专利cn101531666a公开了一种从柚核中提取柠檬苦素的工艺，记载了以醇类有机溶剂作为提取溶剂，通过层析和结晶得到纯度为92％，产率为0.25％的柠檬苦素，柠檬苦素产率和纯度均较低，且有机溶剂用量大。中国专利cn101367823a公开了从吴茱萸中分离柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其通过有机溶剂萃取、柱层析、高效制备液相分离得到纯度为99％的柠檬苦素，该提取工艺存在产率较低的问题，仅为0.1％，且成本太高，目前只适合实验制备。中国专利cn102153615a公开了一种从桔核中提取活性成分的方法，该工艺采用超滤处理，将滤液进行亲和层析，β-葡萄糖酶、糖化酶和α-淀粉酶进行酶解，得到柠檬苦素产率为0.62～0.65％，纯度为98～100％，诺米林的产率为0.085～0.11％，纯度94～97％。提取方法中仍存在酶解不彻底，成本较高，膜处理难以大规模生产的缺点。中国专利cn103421077a公开了一种从柚类果实中分离纯化柠檬苦素类化合物的方法，其采用树脂初步纯化、高速逆流色谱纯化、半制备液相色谱分离三个步骤，其采用的都是实验级别的仪器，难以扩大进行生产。技术实现要素：为克服上述柠檬苦素和诺米林提取过程中存在的问题，本发明提供了一种提取柠檬苦素和诺米林的方法，该方法可促进橘核中柠檬苦素和诺米林的溶出，解决了柠檬苦素提取现有工艺中有机溶剂用量大、提取产率低、提取成本高的问题。本发明方法适用于含柠檬苦素和诺米林的原料，例如芸香科和楝科植物，尤其是柑橘属植物的种子(例如柑橘核、柚核等)。本发明技术方案如下：一种提取柠檬苦素和诺米林的方法，包括：将含柠檬苦素和诺米林的原料脱脂，获得预处理料；采用麦曲复合酶液进行酶解；酶解完成后去除上层清液，获得酶解底料；加入水杨酸钠溶液进行提取，分离提取液；调节ph至4.6～5.0，取上清液上大孔树脂，先用25～30％(体积分数，下同)的乙醇溶液洗脱去除杂质，再用85～90％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，干燥，得浸提物a；将所得浸提物a用二氯甲烷和异丙醇混合溶液加热溶解，过滤去除不溶物，降温，结晶，获得柠檬苦素结晶体；将去除柠檬苦素晶体的滤液减压蒸干获得浸提物b，用乙酸乙酯和乙醇混合溶液加热溶解，过滤去除不溶物，降温，结晶，获得诺米林晶体。进一步地，可用本领域常规方法进行脱脂处理，例如采用石油醚脱脂。为进一步提高脱脂效果，可将原料粉碎至80-100目。进一步地，所述麦曲复合酶液是由酿酒麦曲经浸提而得，优选采用生理盐水或磷酸盐缓冲液(pbs)进行浸提。酿酒领域常用的生麦曲，熟麦曲都可采用。进一步地，所述麦曲复合酶液的制备方法包括：将麦曲粉碎至80-100目，添加其重量2～3倍的生理盐水或磷酸盐缓冲液(ph值6.0～6.5)，于温度4～6℃条件下浸提8～12h，过滤，即得麦曲复合酶液。所述麦曲复合酶液中含有淀粉酶类、纤维素酶类、蛋白酶类等复杂酶系，用于酶解上述预处理料中的淀粉、纤维素和蛋白质等，从而促进柠檬苦素类化合物的溶出，而又对柠檬苦素类物质结构破环较少。进一步地，所述麦曲复合酶液酶解条件：ph为6.0～6.5；温度为40～45℃。酶解时间一般为6～8h。酶解过程可适量加入生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述酶解过程是麦曲复合液中含有的复杂的酶系，如淀粉酶类，纤维素酶类，蛋白酶类等复杂酶系，在一定条件下，酶解橘核处理料中的纤维素、蛋白酶、淀粉等相应的物质，从而促进柠檬苦素类化合物糖苷的溶出。而且酶系中的淀粉酶，糖苷酶等酶类还可水解柠檬苦素类化合物糖苷，促进其结构中糖基的脱落，形成柠檬苦素类化合物。进一步地，所述水杨酸钠溶液的浓度为1.5～1.7mol/l，优选为1.6mol/l。进一步地，所述水杨酸钠溶液与所述酶解底料干重的重量比为6～7:1，优选为6.5:1。进一步地，水杨酸钠溶液的提取温度为52～55℃，提取时间为6～8h；优选地，提取温度为53℃，提取时间为6～8h。一般情况下，每批物料可采用上述方法提取三次。水杨酸钠可与柠檬苦素类物质结合成可溶性盐，从而促进酶解底料中的柠檬苦素类物质的溶出。进一步地，将水杨酸钠溶液的提取液调ph至4.6～5.0。可以常规ph调节剂，优选盐酸。调ph后，水杨酸钠在酸性条件下逐渐转变为水杨酸，其溶解度降低从提取溶液中析出，通过离心去除，以利于后续步骤大孔树脂吸附。本发明还研究发现，若ph过低则会造成柠檬苦素类物质的产率降低。进一步地，优选采用xad-6型大孔树脂。进一步地，用浓度为25～30％的乙醇溶液洗脱去除杂质。进一步地，用浓度为85～90％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。采用上述低浓度乙醇(浓度25～30％)洗脱其目的是洗去树脂吸附的杂质，有利于后续结晶及纯化的操作。本发明研究发现，上述低浓度乙醇洗脱液中杂质含量较高，而且几乎没有柠檬苦素类化合物；而上述高浓度洗脱液中柠檬苦素类物质含量较高。进一步地，所述二氯甲烷和异丙醇混合溶液是由二氯甲烷和异丙醇按体积比1:1.8组成。进一步地，所述二氯甲烷和异丙醇混合溶液与所述浸提物a干重的重量比为11～12:1。进一步地，所述乙酸乙酯和乙醇混合溶液是由乙酸乙酯和异丙醇按体积比5:1组成。进一步地，所述乙酸乙酯和乙醇混合溶液与所述浸提物b干重的重量比为12～14:1。本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。具体地，上述提取柠檬苦素和诺米林的方法，包括以下步骤：a)橘核预处理，选取无霉变干燥的橘核，采用粉碎机粉碎，过80-100目筛；添加石油醚进行脱脂处理，分离液相，减压蒸馏，回收溶剂，获得副产物橘核提取油；将脱脂底料减压蒸干，获得脱脂橘核预处理料；b)麦曲复合酶液制备，取酿酒麦曲，粉碎过筛，添加生理盐水或磷酸盐缓冲液浸提，过滤，离心，获得麦曲复合酶液；c)酶解处理，取上述脱脂橘核预处理料，添加缓冲溶液，并添加麦曲复合酶液进行保温酶解，完成后去除上层清液，获得酶解底料；d)水助溶剂提取，取上述酶解底料添加所述水杨酸钠溶液，在一定条件下进行提取，分离得提取液；e)大孔树脂吸附及洗脱，取上述提取液调节ph后离心，取上清液进行xad-6型大孔树脂吸附，先用低浓度乙醇洗脱去除杂质，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，干燥，获得浸提物a；f)结晶处理，取浸提物a置于40℃条件下干燥，将干燥后的浸膏添加所述二氯甲烷和异丙醇混合溶液进行加热溶解，过滤去除不溶物，降温，结晶，获得柠檬苦素结晶体；将母液减压蒸干获得浸提物b，取浸提物b添加乙酸乙酯和乙醇混合溶液进行加热溶解，过滤去除不溶物，降温，结晶，所得晶体为诺米林晶体。所述步骤b)中麦曲为酿酒过程中采用的生麦曲，和/或熟麦曲。所述复合酶液制备，其制备条件为：麦曲粉碎至80-100目，液料比为2～3l/kg，浸提温度为4～8℃，时间为8～16h。优选为，液料比2l/kg，浸提温度为4～6℃，时间为8～12h。若无特殊指明，本发明所述液料比指液体以体积l计，固体以重量kg计。所述步骤c)中酶解处理条件为：液料比为4～8l/kg，麦曲复合酶液添加量为1～5％(体积分数)，溶液的ph为6.0～6.5，温度为40～45℃，时间为6～8h。优选为，液料比为6～8l/kg，麦曲复合酶液的添加量为2～3％(体积分数)，溶液的ph为6.5，酶解温度为45℃，时间为7h。所述步骤b)和c)中的缓冲溶液为ph为6.0～6.5的磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。所述步骤d中水助溶剂提取条件：提取溶剂为1.5～1.7mol/l的水杨酸钠溶液，液料比6～7l/kg，提取温度为52～55℃，提取时间为6～8h，每批物料提取三次。优选为，水杨酸钠的浓度为1.6mol/l，液料比为6.5l/kg，提取温度为53℃，提取时间为7h。所述步骤e)中提取液调ph是用盐酸将提取液的ph调至4.6～5.0，优选为ph为4.8。所述低浓度乙醇溶液是浓度25～30％的乙醇溶液。所述高浓度乙醇溶液是浓度85～90％的乙醇溶液。所述步骤f)中二氯甲烷和异丙醇混合溶液是由二氯甲烷和异丙醇按体积比1:1.8组成；其与所述浸提物a的液料比为11～12l/kg。所述步骤f)中乙酸乙酯和乙醇混合溶液是由乙酸乙酯和异丙醇体积比5:1组成；其与所述浸提物b的液料比12～14l/kg。较佳地，上述柠檬苦素和诺米林的提取方法，包括以下步骤：1)橘核预处理：选取无霉变干燥的橘核，采用粉碎机粉碎，过80～100目筛，备用；2)脱脂处理：取上述粉碎过的橘核进行脱脂处理，脱脂条件为：脱脂溶剂为沸程为60℃～90℃的石油醚，液料比4～6l/kg，温度为60℃水浴，时间为5～8h，脱脂后获得脱脂橘核预处理料；3)麦曲复合酶液制备：取酿酒麦曲，采用粉碎机粉碎，过100目筛；添加ph为6.0～6.5的磷酸盐缓冲溶液浸提，浸提条件为：液料比2～3l/kg，温度为4～8℃，时间为8～16h；然后将浸提液依次用4层纱布、滤纸过滤，滤液在10000rpm、4℃条件下离心30min，取离心上清液在无菌条件下过0.22μm，获得麦曲复合酶液，4℃保存备用；4)酶解处理：取上述脱脂橘核预处理料添加麦曲复合酶液进行酶解，其条件为:添加ph为6.0～6.5的磷酸盐缓冲溶液(或ph为6.0～6.5的生理盐水)，液料比为4～8l/kg，并添加上述麦曲复合酶液，麦曲复合酶液添加量为总体积的1～5％，溶液ph值为6.0～6.5，酶解温度为40～45℃，搅拌提取6～8h，离心去除上层清液，获得酶解底料；5)水助溶剂提取：将上述酶解底料添加1.5～1.7mol/l的水杨酸钠溶液进行提取，液料比为6～7l/kg，温度为52～55℃，时间为6～8h；提取过程采用三级四罐式逆流提取方式，提取完成后分离提取液；6)大孔树脂吸附解析：用1mol/l盐酸调节将上述提取液的ph调至4.6～5.0，离心分离沉淀水杨酸(可循环使用)；取上清液进行树脂吸附，将预处理好的xad-6型大孔吸附树脂进行填柱(10.8×200cm)，树脂装量为50l，流速为50ml/min，进行吸附；吸附完成后，先用2～4倍柱体积的25～30％的乙醇冲洗去除杂质；再用3～6倍柱体积的85～90％的乙醇进行洗脱大孔树脂，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得浸提物a。7)柠檬苦素结晶：将所述浸提物a在40℃条件下干燥，按液料比为11～12l/kg添加二氯甲烷和异丙醇(体积比为1:1.8)混合溶液，加热至40℃，趁热过滤去除不溶物，降温，于4℃条件下结晶，所得晶体为柠檬苦素结晶体；将母液减压蒸干，获得浸提物b。8)诺米林结晶：将上述浸提物b，按液料比12～14l/kg的量添加乙酸乙酯和乙醇(体积比5:1)溶液，加热至40℃溶解，趁热过滤去除不溶物，降温，在4℃条件下结晶，得白色结晶物，所得晶体为诺米林晶体。本发明方法所制备的橘核柠檬苦素的产率为0.75～0.80％，纯度为98％以上；诺米林的产率为0.12～0.14％，纯度96％以上。综上所述，与现有技术相比，本发明柠檬苦素和诺米林的提取方法具有如下优点：1.本发明所述的柠檬苦素和诺米林的提取方法，其中采用麦曲复合酶液作用于橘核脱脂处理底料，其中含有的纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶类可促进底料中柠檬苦素类物质的溶出，其中淀粉酶类还可促进其配糖体转化为柠檬苦素类物质，增加目标产品的提取率。2.本发明所述的柠檬苦素和诺米林的提取方法，其采用水助溶剂提取法，减少了整个提取过程中的有机溶剂的用量，减少环境的污染。3.本发明采用麦曲浸提液作为复合酶水解橘核底料，因麦曲市售价格为4-10元/kg，以此作为酶源，其具有比采用单一酶或单酶混合成的复合酶液，费用低的优点，具有降低生产成本的目的。附图说明图1为柠檬苦素和诺米林混合对照品溶液色谱图；图2为柠檬苦素含量测定标准曲线；图3为诺米林含量测定标准曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。实施例11)橘核预处理：选取无霉变干燥的橘核，采用粉碎机粉碎，过80-100目筛，备用。2)脱脂处理：取上述粉碎过的橘核进行脱脂处理，其脱脂条件为：脱脂溶剂为沸程为60℃～90℃的石油醚，液料比5l/kg，温度为60℃水浴，时间为6h，脱脂后获得橘核预处理料。3)麦曲复合酶液制备：取酿酒麦曲，采用粉碎机粉碎，过100目筛。添加ph为6.0的磷酸盐缓冲溶液浸提，浸提条件为：液料比2.5l/kg，温度为6℃，时间为12h。然后将浸提液依次用4层纱布、滤纸过滤，滤液在10000rpm、4℃条件下离心30min，取离心上清液在无菌条件下过0.22μm，获得麦曲复合酶液，4℃保存备用。4)酶解处理：取橘核预处理料添加麦曲复合酶液进行酶解，其条件为:添加ph为6.0的磷酸盐缓冲溶液，液料比为6l/kg，麦曲复合酶液添加量为总体积的3％，溶液ph值为6.0，酶解温度为40℃，搅拌提取8h，离心去除上层清液，获得酶解底料。5)水助溶剂提取：将上述酶解底料添加溶剂进行提取，其提取条件为:提取溶剂为1.6mol/l的水杨酸钠溶液，液料比为6l/kg，温度为52℃，时间为8h。提取过程采用三级四罐式逆流提取方式，提取完成后分离提取液。6)大孔树脂吸附解析：用1mol/l盐酸调节将上述提取液的ph调至4.8，在4000rpm离心10min分离沉淀。取上清液进行树脂吸附，将预处理好的xad-6型大孔吸附树脂进行填柱(10.8×200cm)，树脂装量为50l，流速为50ml/min，进行吸附；吸附完成后，先用3倍柱体积的体积分数为28％的乙醇冲洗去除杂质；再用4倍柱体积的体积分数为88％的乙醇进行洗脱大孔树脂，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得浸提物a。7)柠檬苦素结晶：将浸提物a在40℃条件下干燥，按液料比为11l/kg添加二氯甲烷和异丙醇(体积比为1:1.8)混合溶液，加热至40℃，趁热过滤去除不溶物，降温，于4℃条件下结晶，所得晶体为柠檬苦素结晶体。将母液减压蒸干，获得浸提物b。8)诺米林结晶：将上述浸提物b，按液料比12l/kg的量添加乙酸乙酯和乙醇(体积比5:1)溶液，加热至40℃溶解，趁热过滤去除不溶物，降温，在4℃条件下结晶，得白色结晶物，所得晶体为诺米林晶体。上述方法，获得的活性成分柠檬苦素的产率为0.79％，纯度为98.6％；诺米林的产率为0.13％，纯度96.8％。实施例2步骤1)-3)与实施例1相同。4)酶解处理：取橘核预处理料添加麦曲复合酶液进行酶解，其条件为:添加ph为6.0的磷酸盐缓冲溶液，液料比为8l/kg，麦曲复合酶液添加量为总体积的5％，溶液ph值为6.2，酶解温度为42℃，搅拌提取8h，离心去除上层清液，获得酶解底料。5)水助溶剂提取：将上述酶解底料添加溶剂进行提取，其提取条件为:提取溶剂为1.7mol/l的水杨酸钠溶液，液料比为7l/kg，温度为53℃，时间为8h。提取过程采用三级四罐式逆流提取方式，提取完成后分离提取液。步骤6)-8)与实施例1相同。上述方法，获得的活性成分柠檬苦素的产率为0.77％，纯度为99.1％；诺米林的产率为0.12％，纯度96.2％。实施例3步骤1)-4)与实施例1相同5)水助溶剂提取：将上述酶解底料添加溶剂进行提取，其提取条件为:提取溶剂为1.5mol/l的水杨酸钠溶液，液料比为6l/kg，温度为52℃，时间为8h。提取过程采用三级四罐式逆流提取方式，提取完成后分离提取液。6)大孔树脂吸附解析：用1mol/l盐酸调节将上述提取液的ph调至5.0，在4000rpm离心10min分离沉淀。取上清液进行树脂吸附，将预处理好的xad-6型大孔吸附树脂进行填柱(10.8×200cm)，树脂装量为50l，流速为50ml/min，进行吸附；吸附完成后，先用3倍柱体积的体积分数为25％的乙醇冲洗去除杂质；再用5倍柱体积的体积分数为85％的乙醇进行洗脱大孔树脂，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得浸提物a。步骤7)-8)与实施例1相同。上述方法，获得的活性成分柠檬苦素的产率为0.78％，纯度为98.2％；诺米林的产率为0.13％，纯度97.1％。对比例1步骤1)-2)与实施例1相同.3)酶解处理：取橘核预处理料添加复合酶液(100u/mg的β-葡聚糖酶、20u/mg的糖化酶和20u/mg的α-淀粉酶质量比1∶1∶1组成)进行酶解，其条件为:添加ph为6.0的磷酸盐缓冲溶液，液料比为6l/kg，复合酶液添加量为总体积的7％，溶液ph值为6.0，酶解温度为45℃，搅拌提取10h，离心去除上层清液，获得酶解底料。步骤4)-7)与实施例1中步骤5-8相同利用上述方法，获得的活性成分柠檬苦素的产率为0.65％，纯度为98.1％；诺米林的产率为0.09％，纯度94.2％。对比例2步骤1)-4)与实施例1相同5)有机溶剂提取:取上述酶解底料添加有机溶剂提取，其提取条件为：提取溶剂体积分数为85％丙酮，液料比为20l/kg，提取时间为30min，罐式提取三次，合并上提取液，减压蒸馏，回收丙酮，干燥，获得浸提物。步骤6)-7)与实施例1步骤7)-8)相同。利用上述方法，获得的活性成分柠檬苦素的产率为0.72％，纯度为93.2％；诺米林的产率为0.11％，纯度89.1％。对比例3步骤1)-4)与实施例1相同5)有机溶剂提取:取上述酶解底料添加有机溶剂提取，其提取条件为：提取溶剂体积分数为95％乙醇，液料比为20l/kg，提取时间为30min，罐式提取三次，合并上提取液，减压蒸馏，回收乙醇，干燥，获得浸提物。步骤6)-)7与实施例1步骤7)-8)相同。利用上述方法，获得的活性成分柠檬苦素的产率为0.73％，纯度为92.2％；诺米林的产率为0.10％，纯度87.6％。实施例1-3及对比例1-3中柠檬苦素和诺米林提取产物的质量指标，如表1所示。表1各实施例及对比例提取方法的产率及纯度数据表项目柠檬苦素产率％柠檬苦素纯度％诺米林产率％诺米林纯度％实施例10.7998.60.1396.8实施例20.7799.10.1296.2实施例30.7898.20.1397.1对比例10.6598.10.0994.2对比例20.7293.20.1189.1对比例30.7392.20.1087.6由表1结果可以看出，实施例1-3与对比例1-3相比，其柠檬苦素和诺米林产率及纯度较高。对比例2-3中柠檬苦素和诺米林提取产率与实施例1-3相差很小，但其提取产品纯度较低。其中，表1中各参数的测定方法如下：柠檬苦素和诺米林含量的检测方法仪器：agilentl200型高效液相色谱仪；dad二极管阵列检测器；数显恒温水浴锅；紫外-可见分光光度仪；色谱柱:dikmac18柱(250mm×4.6mm，5μm)。材料：柠檬苦素及诺米林对照品均购于四川维克奇生物科技有限公司(纯度≥98％)，所用试剂甲醇为色谱纯，石油醚、二氯甲烷为分析纯，超纯水；方法:色谱条件:色谱柱:dikmac18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(65:35)，流速:1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长:210nm；上样量:10μl。标准溶液配制，精密称取柠檬苦素、诺米林对照品适量，分别置于容量瓶中用色谱甲醇稀释至刻度，摇匀，制得柠檬苦素、诺米林的浓度分别为0.372mg/ml和0.242mg/ml。并以此为母液，配制成一系列浓度梯度的标准溶液，柠檬苦素浓度分别为:0.0372mg/ml，0.0744mg/ml，0.1488mg/ml，0.2232mg/ml，0.2976mg/ml，0.3720mg/ml；诺米林浓度分别为:0.0484mg/ml，0.0968mg/ml，0.1452mg/ml，0.1936mg/ml，0.2420mg/ml。供试样品溶液的制备：精密称取柠檬苦素和诺米林供试样品，采用色谱级甲醇溶解柠檬苦素样品，配制成含量为0.2500mg/ml，诺米林样品配制成0.2000mg/ml的溶液。结果：在上述色谱检测条件检测混合对照品(柠檬苦素和诺米林)，可见橘核中两种化合物得到的了良好的分离效果(图1所示)。按相同色谱条件测定柠檬苦素和诺米林峰面积，得到以峰面积为横坐标x对柠檬苦素和诺米林浓度y(mg/ml)的线性回归方程。结果表明柠檬苦素在0.0372-0.3720mg/ml范围内(图2)，诺米林在0.0484～0.2420mg/ml范围内呈良好的线性关系(图3)。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12