本发明涉及一种细菌感染的分子生物学检测和鉴定技术领域，尤其涉及解脲脲原体感染的分子生物学检测和鉴定的方法。
背景技术：
解脲脲原体是一类原核细胞微生物，体积介于细菌和病毒之间，是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症状，围产期感染和不育症都有关系，是性传播疾病的病原体之一。值得注意的是，在孕妇中，解脲脲原体感染者较多，国外有报道为80％，而我国报道有55.12％。在这个时期感染解脲脲原体，不仅危害母亲健康，而且危害胎儿生存，很容易发生低体重儿，新生呼吸道感染，中枢神经系统感染，胎儿死亡等严重后果。
目前，解脲脲原体的实验室检测方法有：培养法，免疫学检测法，核酸扩增试验等。传统的检测方法包括培养和免疫法等普遍存在检出率低，周期长，特异性差等缺点，给临床诊断带来困难。
分子生物学方法现有技术通常采用的是实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneousamplificationandtesting，简称sat)，该技术是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。与传统的检测方法相比具有高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定。
目前我国对解脲脲原体(uu)的检测在临床上主要为培养和核酸检测。uu的液体培养法设备简单、经济，培养时间一般在24小时，但存在假阳性和假阴性的结果，还需固体培养鉴定。需要医生和实验室之间密切配合，特别要注意样品的采集、培养基的选择、正确接种和鉴定等步骤。
国内市场上的uu核酸检测试剂盒主要是pcr-荧光检测试剂盒，它具有快速、灵敏、特异、简便的优点，可以直接检测临床标本中极微量的病原体，但由于其本身技术原理的原因，容易造成假阳性污染。最新发展的扩增技术是gen-probe公司的转录介导的扩增(tma)，其优点是每个感染细胞中有大量的rrna，而且操作步骤简便，只是一个恒温过程，不需要变换温度的扩增仪。由于检测方法是终点检测，容易导致环境污染，tma技术无检测uu的产品，国内尚无采用该法进行检测的报道。
由于rna核酸检测技术的高灵敏度和特异性，在具备分子生物学条件的实验室，可以采用该方法常规检测应用，但是如何提取纯净的rna靶标是目前的一大难题。
目前解脲脲原体的实验室检测方法主要有：培养法，免疫学检测方法和分子生物学方法，将现有技术的检测方法进行一个比较，参见表1，可以发现现有技术检测方法的明显的缺陷在于：操作较复杂，需有一定经验才能做好检测，且耗时长、手工操作，较复杂。
表1各检测方法比较表
技术实现要素：
为了克服现有技术检测方法中的以上缺陷，本申请提供了基于rna靶标的sat的解脲脲原体感染分子生物学检测方法，其发明构思在于：通过特异性靶标捕获技术获取纯净rna靶标，并且与荧光恒温扩增检测技术(sat)的结合，将rna靶标和sat技术的优点有机结合，当然本发明的技术方案并不是两种技术的简单叠加，而是通过特异性靶标捕获技术，也可以称为磁珠法获得纯净的细菌靶核酸(rna)作为精确检测解脲脲原体感染感染的最重要的基础；实时荧光核酸恒温扩增检测技术使用m-mlv反转录酶、t7rna多聚酶和优化探针技术来同时实现，从而克服了操作较复杂，需有一定经验才能做好检测，且耗时长、手工操作，较复杂的缺陷。
一种基于rna靶标的sat的解脲脲原体感染分子生物学检测方法，包括如下步骤：
步骤一，采用特异性靶标捕获技术，即磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即rna作为靶标；
步骤二，采用rna实时荧光恒温扩增检测技术得到解脲脲原体感染的检测结果，所述rna实时荧光恒温扩增检测技术使用反转录酶、rna多聚酶和优化探针同时实现；
步骤三，结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果进行判定，并进行菌种试验。
优选的，所述步骤一包括：
(1-1)手工提取靶标核酸特异性：包括在磁珠微粒表面标记oligo(dt)，在该段oligo(dt)上连接带有一段oligo(da)的特异性的核酸捕获片段，当捕获探针与靶标核酸结合后，用磁铁吸附磁珠，即可提取靶标核酸特异性；
(1-2)获取纯净的细菌靶核酸，即rna做为靶标：包括在核酸提取的过程中，病原体裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，清洗磁性颗粒获得纯净的细菌靶核酸rna，最大限度的将样本中的杂质去除掉，保证反应时的特异性。
优选的，所述步骤二包括：
(2-1)反转录酶为m-mlv反转录酶，产生靶标核酸rna的一个dna拷贝；
(2-2)rna多聚酶为t7rna多聚酶，从dna拷贝上产生多个rna拷贝；
(2-3)将带有荧光标记的优化探针和所述步骤一提取的rna拷贝特异结合，从而产生荧光，所述荧光信号由检测仪器捕获，根据实时获得的所述荧光信号的出现时间和强度得到解脲脲原体感染的检测结果。
优选的，所述步骤三结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果，并进行菌种试验进行判定包括：应用临界弱阳性对照进行实验室质控，为了防止漏检(假阴性)的情况，sat实验室检测应定期应用临界弱阳性对照进行实验室质控。实验室质量控制：所设置的阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的dt应满足：界值参考值的dt在10-20之间；阳性对照dt≦弱阳性dt≦35，阴性对照dt无数值或者为40。否则试验视为无效需重新进行，其中，dt表示样品曲线与阈值线交点的横坐标读数，进行菌种鉴别试验，包括利用pcr技术从短小芽孢杆菌基因组中扩增出16srrna序列，然后连接测序载体，完成测序后进行ncbi比对分析，确定菌种的分类学位置。
优选的，所述步骤(1-1)手工提取靶标特异性以及步骤(1-2)获取纯净的细菌靶核酸使用到磁珠分离器、电动吸引器、干式恒温仪和连续微量加样器完成。
优选的，所述步骤(1-1)手工提取靶标特异性以及步骤(1-2)获取纯净的细菌靶核酸还可以通过magx全自动核酸提取仪完成所有的提取过程，提取出来的核酸在荧光pcr仪器上进行扩增检测。
新的改良后的sat技术吸取各种技术的优势，以纯净的rna为模板进行扩增，并进行实时检测，并且采用非侵入式样本取样，有效节约了医疗资源，并给患者带来便利，检测成本低，可受惠于更多患者，作为最新的诊断技术，具有快速、灵敏、特异、简便，极大降低漏检、误检率。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。本发明的目标及特征考虑到如下结合附图的描述将更加明显，附图中：
图1为根据本发明实施例的采用特异性靶标捕获技术，即磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即rna作为靶标的原理图；
图2为根据本发明实施例的采用rna实时荧光恒温扩增检测技术得到解脲脲原体感染的检测结果的原理图。
具体实施方式
本实施例针对一种基于rna靶标的sat的解脲脲原体感染分子生物学检测方法，通过特异性靶标捕获技术获取纯净rna靶标，并且与荧光恒温扩增检测技术(sat)的结合，将rna靶标和sat技术的优点有机结合，当然本发明的技术方案并不是两种技术的简单叠加，而是通过特异性靶标捕获技术，也可以称为磁珠法获得纯净的细菌靶核酸(rna)作为精确检测解脲脲原体感染感染的最重要的基础；实时荧光核酸恒温扩增检测技术使用m-mlv反转录酶、t7rna多聚酶和优化探针技术来同时实现，包括如下步骤：
参见图1，步骤一，采用特异性靶标捕获技术，即磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即rna作为靶标，使用到磁珠分离器、电动吸引器、干式恒温仪和连续微量加样器完成，当然还可以通过magx全自动核酸提取仪完成所有的提取过程，提取出来的核酸在荧光pcr仪器上进行扩增检测，具体操作包括：
(1-1)手工提取靶标核酸特异性：包括在磁珠微粒表面标记oligo(dt)，在该段oligo(dt)上连接带有一段oligo(da)的特异性的核酸捕获片段，当捕获探针与靶标核酸结合后，用磁铁吸附磁珠，即可提取靶标核酸特异性；
(1-2)获取纯净的细菌靶核酸，即rna做为靶标：包括在核酸提取的过程中，病原体裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，清洗磁性颗粒获得纯净的细菌靶核酸rna，最大限度的将样本中的杂质去除掉，保证反应时的特异性；
参见图2，步骤二，采用rna实时荧光恒温扩增检测技术得到解脲脲原体感染的检测结果，所述rna实时荧光恒温扩增检测技术使用反转录酶、rna多聚酶和优化探针同时实现；包括：
(2-1)反转录酶为m-mlv反转录酶，产生靶标核酸rna的一个dna拷贝；
(2-2)rna多聚酶为t7rna多聚酶，从dna拷贝上产生多个rna拷贝；
(2-3)将带有荧光标记的优化探针和所述步骤一提取的rna拷贝特异结合，从而产生荧光，所述荧光信号由检测仪器捕获，根据实时获得的所述荧光信号的出现时间和强度得到解脲脲原体感染的检测结果；
步骤三，结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果，并进行是否为活菌的区分试验进行判定包括：应用临界弱阳性对照进行实验室质控，为了防止漏检(假阴性)的情况，sat实验室检测应定期应用临界弱阳性对照进行实验室质控。实验室质量控制：所设置的阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的dt应满足：界值参考值的dt在10-20之间；阳性对照dt≦弱阳性dt≦35，阴性对照dt无数值或者为40，否则试验视为无效需重新进行，其中dt表示样品曲线与阈值线交点的横坐标读数，进行菌种鉴别试验，包括利用pcr技术从短小芽孢杆菌基因组中扩增出16srrna序列，然后连接测序载体，完成测序后进行ncbi比对分析，确定菌种的分类学位置。
表2为本实施例实施的场所和设备详细介绍。
表2
新的改良后的sat技术吸取各种技术的优势，以纯净的rna为模板进行扩增，并进行实时检测，作为最新的诊断技术，具有快速、灵敏、特异、简便，极大降低漏检、误检率。
虽然本发明已经参考特定的说明性实施例进行了描述，但是不会受到这些实施例的限定而仅仅受到附加权利要求的限定。本领域技术人员应当理解可以在不偏离本发明的保护范围和精神的情况下对本发明的实施例能够进行改动和修改。