本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测大豆北方茎溃疡病菌raa荧光法检测的引物、探针和试剂盒。
背景技术：
大豆(glycinemax)是我国重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要来源，在我国国民经济中占有重要地位。目前我国大豆产量居世界第四位，但仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增，各种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。
大豆在我国分布很广，主产区集中在东北三省、黄淮海平原以及长江中下游地区。常年种植面积占粮食耕地面积的8％～10％，仅次于水稻、小麦、玉米，在国民经济中占有重要地位。由于我国大豆生产成本高、质量差和国内市场交易成本高，而美国、阿根廷、巴西等国普遍采用转基因技术，且生产机械化程度高、成本低、含油量高，从而导致大豆进口猛增。2005年，我国首次从宁波检验检疫局查检美国进境大豆发现此批大豆含有大豆北方茎溃疡病菌，进境大豆都携带大量的豆杆、豆荚及其他杂质，带菌的可能性很大。在进境大豆的运输、加工、下脚料的处理过程中都有传播扩散的可能。一旦传入将对我国大豆生产造成严重影响。
大豆茎溃疡病是由大豆茎溃疡病菌感染大豆所引起的疾病，且严重影响大豆的生产，在某些地区损失率高达100％。目前主要分布于巴西、玻利维亚、巴拉圭、美国、阿根廷等美洲地区，在欧洲部分地区如保加利亚、意大利亦有分布，迄今为止，在我国暂未发现大豆茎溃疡病菌，但是从文献相关报道来看，疫情还在不断蔓延，严重影响大豆生产。
大豆茎溃疡病分大豆北方茎溃疡病和大豆南方茎溃疡病，其病原体分别为大豆北方茎溃疡病菌(diaporthephaseolorumvar.caulivora，dpc)和大豆南方茎溃疡病菌(diaporthephaseolorumvar.meridionalis，dpm)，这两种大豆真菌病害目前严重影响大豆生产及贸易，具有检疫重要性和经济重要性。由于传入风险高，但我国绝大部分地区都适合该病菌生长，因此已经被我国列为检疫性有害生物，由此亟需一种快速简便方法应对口岸进出货物检测。
大豆北方茎溃疡病菌于1950年在美国爱荷华州首次发现，随后在美国南部地区发现大豆南方茎溃疡病菌，两者的区别在于发生地理范围不互相覆盖，分离的病原物的培养形态有差别，且大豆南方茎溃疡病的侵染性比大豆北方茎溃疡病强。
dpc属于子囊菌门、球壳目、间座壳科、间座壳属。该病菌侵染植株后迅速发展形成茎杆环状损伤，并可导致正在生长的植株死亡。发病严重的田块有80％的植株受到侵染，造成严重的经济损失。在美国、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、意大利、前南斯拉夫、克罗地亚等欧洲部分国家及地区有发生报道，是国外大豆生产上的重要病害。
目前检测大豆茎溃疡病的方法主要包括分离培养技术、分子生物检测技术等。
1、分离培养技术：
国际种子检验协会(internationalseedtestingassociation，ista)采用该技术检测大豆种子中有无携带大豆茎溃疡菌。其方法如下：挑取表面发白、皱缩的不健康种子，使用1％次氯酸钠溶液消毒30s，然后在灭菌水中漂洗3次，并置于灭菌吸水纸上晾干，在pda培养基中培养发现有特征性菌落后，可分离培养作进一步鉴定。该方法时间周期长，检出率低。
2、豆杆保湿培养法
在培养皿中铺双层滤纸，经高压灭菌后，滴加灭菌水至充分湿润。将灭菌的豆杆平铺在消毒滤纸上。在25℃黑暗环境培养7天后，利用10～20倍解剖镜观察有无子囊壳或分生孢子器产生，再用挑针挑取孢子液进行培养。同时观察子囊、子囊孢子、分生孢子的形态与大小，最后作进一步鉴定。该方法时间周期长，检出率低。
常见的分子生物检测技术主要有pcr和lamp技术。
pcr技术是聚合酶链式反应的简称，创立于1985年，目前已成为病原微生物检测的常规技术，是利用dna在体外摄氏95°高温时变性解链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。这种方法灵敏、特异、检出率高，但该方法对仪器温度要求及人员的专业素养要求高，且需要一定的硬件支持，检测时间1.5－2小时，对提取的dna纯度要求高。
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是由日本学者notomit等人针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟其扩增效率可达到109～1010个数量级。但此方法设计设计复杂，假阳性出现高。
综上所述，传统方法如分离培养技术耗时较长，操作繁琐，采用pcr技术，虽然结果精确度高，需昂贵仪器，装备精良的实验室和专业的操作人员。lamp法不需要昂贵的pcr仪，等温灵敏、特异性强、操作简单且易于观察结果，但是lamp技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，假阳性高，不利于在基层实验室推广使用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种大豆北方茎溃疡病菌的raa荧光法检测法及所用引物探针及试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明一种raa荧光法检测大豆北方茎溃疡病菌的探针，所述探针为5’端序列/荧光报告基团//cthf//淬灭基团/3’端序列；其中：
所述5’端的核苷酸序列为：cagctgtctgcgtgcggccatttgcgccgcat；
所述3’端的核苷酸序列为：tcacacctggaggcg；
所述thf为1个碱基位置；
所述荧光报告基团选自fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5中的任一种；
所述淬灭基团选自tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl中的任一种。
作为本发明的raa荧光法检测大豆北方茎溃疡病菌的探针的改进，所述探针的核苷酸序列为：cagctgtctgcgtgcggccatttgcgccgcatcatcacacctggaggcg。
本发明还同时提供了一种大豆北方茎溃疡病菌raa荧光法检测试剂盒，该试剂盒包括如上所述的探针以及上游引物和下游引物；
上游引物为：
5’-catcgagaagttcgagaaggaaggttagtg-3’；
下游引物为：
5’-gcgacggcaggtgtggtaagagtggtggcggaaatg-3’。
作为本发明的大豆北方茎溃疡病菌raa荧光法检测试剂盒的改进：本发明对探针和引物在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述的探针使用时在反应体系中的终浓度为0.02～0.05mm，所述上游引物及下游引物使用时在反应体系中的终浓度为0.05～0.1mm。
作为本发明的大豆北方茎溃疡病菌raa荧光法检测试剂盒的进一步改进：所述试剂盒还包括试剂raa基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。
其中：所述的raa基础荧光通用反应试剂是经过低温冷冻干燥的冻干粉，由江苏奇天基因生物科技有限公司提供；是f00001(商品货号)的基础反应单元。本领域技术人员，也可以根据raa荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为raa基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。
作为本发明的大豆北方茎溃疡病菌raa荧光法检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液由以下试剂组成：在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述反应缓冲液中各组分的使用浓度为450mm的tris-hclbuffer(ph7.6)、260mm的mgac和10％w/v(即，10g/100ml)的peg10000；余量为作为溶剂的水。
作为本发明的大豆北方茎溃疡病菌raa荧光法检测试剂盒的进一步改进，所述试剂盒还包括如下试剂：阴性质控品、阳性质控品和/或临界阳性质控品；
所述阳性质控品含为大豆北方茎溃疡病菌的基因组dna片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，阳性质控品的使用浓度为1.0×104copies/ul；也可以选择高于此浓度的任意一个浓度作为阳性质控品。
所述临界阳性质控品为含大豆北方茎溃疡病菌的基因组dna片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，临界阳性质控品的使用浓度为1.0×103copies/ul；
所述阴性质控品为不含有大豆北方茎溃疡病菌的基因组片段的试剂(即，不含有大豆北方茎溃疡病菌的基因组片段的dna质粒)。
具体而言，本发明公开一种raa荧光法检测大豆北方茎溃疡病菌的探针，探针核苷酸序列为：
cagctgtctgcgtgcggccatttgcgccgcatcatcacacctggaggcg，所述探针按以下方式进行修饰：
5’端序列/荧光报告基团//cthf//淬灭基团/3’端序列。
本发明中具体使用的探针修饰后按如下方式合成：
5’-cagctgtctgcgtgcggccatttgcgccgca/i6famdt//cthf//ibhqdt/cacacctggaggcg-3’。
其设计要点在于：所述荧光探针修饰在探针中间，荧光报告基团修饰在离5'端碱基数32bp的位置上、淬灭基团修饰在离3'端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间隔2个碱基位置，其中1个碱基用于修饰四氢呋喃残基。
使用上述试剂盒检测大豆北方茎溃疡病菌的方法，包括如下步骤：
(1)、提取待测样品的dna；用ctab法进行大豆北方茎溃疡病菌dna的提取，也可以采用商业化的dna提取试剂盒提取待测样品的dna；
(2)反应buffer配制：取47μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将配制好的49μl试剂加入到已分装冻干的raa基础荧光通用反应试剂冻干粉中(每管2μg冻干粉)，使其充分溶解并混均；再加入1μl待测样品dna为模板，总体积为50μl，充分混均；
(3)放入检测fam荧光检测仪器中进行实时raa荧光法反应；实时raa荧光法反应条件设定为：反应温度39℃，反应时间5～20min；
(4)结果分析：
在反应时间(例如20min)之内fam荧光检测仪器检测到信号明显增加，即增加量为≥荧光起始量的30％，显示有扩增判定为阳性；反之(即，在反应时间之内fam荧光仪器信号无增加或无明显增加)，则判定为阴性。
本发明的技术优势在于：本发明解决了现有技术检测方法在检测大豆北方茎溃疡病菌中所存在的费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高等问题。本发明采用raa技术，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。具有快速、灵敏、操作简便等特点，对未来检测大豆北方茎溃疡病菌传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。
综上所述，本发明的利用raa技术能够快速检测大豆北方茎溃疡病菌，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。本发明所提供的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明实施例1的灵敏度检测扩增图；
图2为本发明大豆北方茎溃疡病菌实际样本检测扩增图；
图3为本发明大豆北方茎溃疡病菌样本特异性实施例检测扩增图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。但本发明的内容并不局限于此。
以下实施例中引物探针及dna质粒均可由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；
实施例1、大豆北方茎溃疡病菌的raa荧光检测法灵敏度：
选择大豆茎溃疡病菌的特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(ncbi)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得大豆茎溃疡病菌基因序列，并进行多序列比对，并从中选出一段保守序列，该序列如下：catcgagaagttcgagaaggaaggttagtgaatatccaaacatccagcaaatgcttccactcccatcccagtgctactcgcagctgtctgcgtgcggccatttgcgccgcatcatcacacctggaggcgcattttcacccctcgctctggattttccattttcagtgcgggtgcggggtgcgcttatctggggggcttatcttccgcctgcaaaaccctgttacatcacccctcccaaccaccatttccgccaccactcttaccacacctgccgtcgcccgcccacatcaaagcaaga；根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成dna质粒，质粒大小298bp。
根据raa技术引物及探针设计原则进行设计，通过筛选和评价，最终确定的：
上游引物序列5’-catcgagaagttcgagaaggaaggttagtg-3’；
下游引物序列5’-gcgacggcaggtgtggtaagagtggtggcggaaatg-3’；
探针序列及修饰方法为：
5’-cagctgtctgcgtgcggccatttgcgccgca/i6famdt//cthf//ibhqdtcacacctggaggcg-3’。
其中，fam为荧光报告基团，bhq为荧光淬灭基团，thf为四氢呋喃残基，修饰方法为fam：6-carboxyfluorescein；thf:tetrahydrofuran；bhq:blackholequencher；phosphate:3’phosphatetoblockelongation。
表1、为引物和探针的相关信息表
表2、本发明试剂盒组成
为了方便进行试剂盒的灵敏度测定，将由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的大豆北方茎溃疡病菌dna质粒转化至大肠杆菌中，37℃扩培8小时，采用商品化的质粒提取试剂盒进行大豆茎溃疡病菌dna质粒，经浓度测定后将其浓度稀释至1010copies/ul备用；
将5ul1010copies/ul大豆茎溃疡病菌dna质粒制备成不同梯度的工作标准品，分别为：
工作标准品1，含有1.0×107copies/ul大豆北方茎溃疡病菌的基因dna片段。
工作标准品2，含有1.0×106copies/ul大豆北方茎溃疡病菌的基因dna片段。
工作标准品3，含有1.0×105copies/ul大豆北方茎溃疡病菌的基因dna片段。
工作标准品4，含有1.0×104copies/ul大豆北方茎溃疡病菌的基因dna片段。
工作标准品5，含有1.0×103copies/ul大豆北方茎溃疡病菌的基因dna片段。
工作标准品6，含有1.0×102copies/ul大豆北方茎溃疡病菌的基因dna片段。
反应buffer配制：按吸取376μl反应缓冲液，加入16μl探针与引物的混合物，充分混均；分别吸取混均后49μl试剂加入到7个raa基础荧光通用反应试剂管(每管2μg冻干粉)中，使冻干粉充分溶解并混均；
在7个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如图1所示。结果显示最快2分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增。
说明：当荧光增加量为荧光起始量的30％，判定为阳性。
实施例2
引物探针与实施例1相同。
试剂盒同实施例1的表2。
样本来源及dna提取：
样本由浙江省检验检疫科学技术研究院提供，为大豆北方茎溃疡病菌提取的dna，提取好的dna在-80℃保存备用。
反应buffer配制：取三个反应管，分别按如下操作，吸取47μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的49μl试剂加入到raa基础荧光通用反应试剂管(每管2μg冻干粉)中，使冻干粉充分溶解并混均；
在3个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、1μl提取好的大豆北方茎溃疡病菌样本dna(浓度为20ng/μl)，1μl阳性质控品为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如图2所示。结果显示3分钟明显有扩增。
实施例3
引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。
试剂盒同实施例1的表2。
样本来源及dna提取：
大豆北方茎溃疡病菌样本、大豆南方茎溃疡病菌样本、大豆拟茎点种腐病菌、镰刀菌、大豆茎荚枯腐病菌、大豆紫斑病菌、大豆炭疽病菌dna由浙江省检科院提供，提取好dna在-80℃保存备用。
提取待测样品的dna；用ctab法进行大豆北方茎溃疡病菌dna的提取，也可以采用商业化的dna提取试剂盒提取待测样品的dna。
反应buffer配制：取一个1.5ml的pe管，按如下操作，吸取423μl反应缓冲液加入pe管，再吸取18μl探针与引物的混合物加入423μl反应缓冲液中，充分混均；
取8个raa基础荧光通用反应试剂管(每管2μg冻干粉)，分别加入混均后的配制反应液49μl，使冻干粉充分溶解并混均；将混均后的缓冲液49μl试剂加入到raa基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；
在8个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、大豆北方茎溃疡病菌样本(浓度为20ng/μl)、大豆南方茎溃疡病菌样本(浓度为20ng/μl)、大豆拟茎点种腐病菌(浓度为20ng/μl)、镰刀菌(浓度为20ng/μl)、大豆茎荚枯腐病菌(浓度为20ng/μl)、大豆紫斑病菌(浓度为20ng/μl)、大豆炭疽病菌(浓度为20ng/μl)dna各1μl为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。
将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。
检测结果如图3所示。结果显示只有大豆北方茎溃疡病菌样本dna明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。
实施例3显示本发明的试剂盒特异性好，可以区分大豆北方茎溃疡病菌的近似种及大豆上常见的病害。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110>浙江省检验检疫科学技术研究院
江苏奇天基因生物科技有限公司
<120>大豆北方茎溃疡病菌的raa荧光检测法及所用引物探针及试剂盒
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>49
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cagctgtctgcgtgcggccatttgcgccgcatcatcacacctggaggcg49
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
catcgagaagttcgagaaggaaggttagtg30
<210>3
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gcgacggcaggtgtggtaagagtggtggcggaaatg36