一种用于检测致病性大肠杆菌O157:H7的RPA-LFD引物对和探针及其应用的制作方法

本发明涉及一种用于检测致病性大肠杆菌o157:h7的rpa-lfd引物对和探针及其应用，属于食品安全检测技术领域。

背景技术：

近年来，国内外食品安全事件层出不穷，食源性致病菌在全世界广泛分布并每年造成成千上万例的人类疾病，是世界头号食品安全问题。据世界卫生组织(who)最新发布的报告显示，全球每年发生食源性疾病达数10亿起，即使在发达国家也至少1/3人患食源性疾病。如美国估计每年约有4,800万例食源性疾病患者，其中12.8万人入院治疗，3000人死亡。在我国，威胁食品安全的最大问题同样是致病性微生物引起的食品污染。据国家卫计委通报，2015年度，我国微生物性食物中毒人数高达3181人，占全年食物中毒总人数的53.7％，为食物中毒人数之最。充分的数据表明，食源性致病菌是导致食源性疾病的主要致病微生物，常伴随食品原料的生产、加工、包装与贮运过程中污染食品，引起食源性疾病，对公众的身心健康造成了严重危害，已成为世界性的公共卫生问题，引起政府部门、食品企业、餐饮单位、研究人员以及消费者的高度关注。在整个细菌性食物中毒病例中，食源性致病菌大肠杆菌o157:h7的感染率与发病率一直居于前列，该菌可通过污染食品、饮用水以及环境而致人类感染，导致出血性腹泻，溶血性尿毒综合征(hus)等临床症状，严重者可致死亡。因此，如何快速、灵敏、高效地对食品供应链中的致病性大肠杆菌o157:h7进行有效监测以应对食源性疾病的发生发展是当前食源性致病菌防控领域拟解决的重大问题。

然而，针对食品中致病性大肠杆菌o157:h7检测，目前多采用传统(改进)培养鉴定技术、pcr及其衍生技术、免疫分析技术、代谢学分析技术、荧光共振能量转移技术、生物传感器技术、基因芯片技术、流式分析技术以及分子逻辑门技术等手段。然而，这些技术手段存在样品处理繁琐、检测周期长、仪器昂贵、试剂费用高、灵敏度低、易发生错检与漏检以及无法对人工难以培养的致病菌进行检测等诸多局限性，因此，不利于暴发疫情时的现场快速诊断与准确溯源，也不符合食源性致病菌检测所要求的快速、特异、敏感原则。因此，针对食品中致病性大肠杆菌o157:h7污染急需开发简便快速、灵敏高效、经济适用的现场可视化检测技术。重组酶聚合酶核酸扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是一种等温核酸扩增技术，可在37-42℃在短时间内将核酸模板扩增到可检测水平，与侧流层析试纸条(lateralflowdipsticks，lfd)结合(rpa-lfd)具有灵敏、特异、简便、可视化以及现场快速等诸多优点，非常适用于食源性致病性大肠杆菌o157:h7的检测。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于检测致病性大肠杆菌o157:h7的rpa-lfd引物对和探针及其应用，以实现对大肠杆菌o157:h7的安全可靠、简便快捷、灵敏高效的现场快速可视化检测。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于检测致病性大肠杆菌o157:h7的rpa-lfd引物对和探针，引物对和探针序列如下：

上游引物eof4的核苷酸序列为seqidno.6；

下游引物eor3的核苷酸序列为seqidno.7；

探针eoprob的核苷酸序列为seqidno.9。

下游引物eor3的5’端应用生物素biotin标记。

探针eoprob的5’端应用羧基荧光素fam标记。

探针eoprob的3’端应用c3-spacer封闭，且离5’端第33位的碱基a为四氢呋喃所替代。

一种rpa-lfd扩增引物对和探针在制备检测致病性大肠杆菌o157:h7的试剂、试剂盒中的应用。

一种rpa-lfd扩增引物对和探针在非疾病诊断或治疗领域的致病性大肠杆菌o157:h7检测中的应用。

非疾病诊断或治疗领域为食品安全检测领域。

一种检测食品中致病性大肠杆菌o157:h7的方法，包括如下步骤：

(1)rpa反应体系：

(2)rpa反应扩增：

将上述除醋酸镁溶液外的试剂依次加入无菌离心管中，充分混匀，将醋酸镁溶液加在无菌离心管管盖内部，盖紧后瞬时离心，离心后混匀迅速放入关闭热盖的pcr仪或恒温水浴中孵育，进行rpa反应；

(3)rpa产物的lfd检测：取2μl带有双抗原fam与biotin标记的rpa扩增产物加入到含有100μlph8.0的tris-clbuffer的96孔微孔板中混匀，然后将lfd试纸条垂直浸入混合溶液中进行显色5min，通过试纸条显色情况判断结果。

rpa反应条件为：40℃、10min。

试纸条的检测线和控制线均呈红色，结果判定为阳性；只有控制线呈红色，检测线未显色，结果判定为阴性；控制线未显色，结果判定为无效。

本发明有益效果：

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测致病性大肠杆菌o157:h7的方法，以实现对大肠杆菌o157:h7的安全、特异、快速、灵敏、简便的现场检测，弥补了现有检测技术的不足。实验证明，本发明rpa-lfd技术的最小反应体积为10μl，最适反应温度是40℃，最短检测时间15min。由rpa反应筛选的最佳引物特异性强，pcr与rpa-lfd分别可检测出100fg与1fg的大肠杆菌o157:h7基因组dna，rpa-lfd灵敏度是pcr的100倍，具有很高的灵敏度。本发明反应体系仅为10μl，而且从提取细菌基因组开始到检测完成总耗时仅为15min，不仅极大地节约了反应成本，而且缩短了检测所需时间，有利于进行大范围推广应用。最后，本发明利用试纸条可实现可视化现场检测，能够及时、有效监测大肠杆菌o157:h7疫情的发生发展，具有重要的公共卫生意义。

附图说明

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1：本发明方法的rpa引物pcr与rpa二重筛选电泳结果图。图中，泳道m为dnamarker，泳道1，2：第1组引物eo1(eof1/eor1)，泳道3，4：第2组引物eo2(eof2/eor2)，泳道5，6：第3组引物eo3(eof3/eor2)，泳道7，8：第4组引物eo4(eof4/eor2)，泳道9，10：第5组引物eo5(eof3/eor3)，泳道11，12：第6组引物eo6(eof4/eor3)，泳道13，14：第7组引物eo7(eof4/eor4)；泳道1、3、5、7、9、11、13分别为第1-7组引物的pcr筛选结果；泳道2、4、6、8、10、12、14分别为第1-7组引物的rpa筛选结果。

图2：大肠杆菌rpa-lfd最佳引物对与探针设计示意图。图中，上游引物eof4与下游引物eor3序列由方框圈出；探针eoprob由加粗下划线表示，其中不加下划线的碱基“a”在探针中被四氢呋喃(thf)替代。

图3：本发明方法的大肠杆菌o157:h7rpa反应体积优化结果图。图中，泳道m为dnamarker，泳道1-10分别对应rpa反应体积5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl与50μl。

图4：本发明方法的大肠杆菌o157:h7rpa反应时间优化结果图。图中，泳道m为dnamarker，泳道1-6依次对应反应时间5min、10min、15min、20min、25min与30min；图4a为rpa反应时间优化rpa-age结果图；图4b为rpa反应时间优化rpa-lfd结果图，c为对照线，t为检测线。

图5：本发明方法的大肠杆菌o157:h7rpa反应温度优化结果图。图中，泳道m为dnamarker，泳道1-6依次对应rpa反应温度37℃、38℃、39℃、40℃、41℃与42℃优化结果图；图5a为rpa反应温度优化的rpa-age结果图；图5b为rpa反应温度优化的rpa-lfd结果图，c为对照线，t为检测线。

图6：本发明方法的大肠杆菌o157:h7的rpa反应特异性分析结果图。图中，泳道m为dnamarker，泳道1为阳性对照质粒rpucm-rfbe；泳道2-12依次对应大肠杆菌o157:h7、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌与空肠弯曲杆菌基因组dna；图6a为rpa反应特异性的rpa-age结果图；图6b为rpa反应特异性的rpa-lfd结果图，c为对照线，t为检测线。

图7：本发明方法的大肠杆菌o157:h7基因组dna的敏感性分析结果图。图中，泳道m为dnamarker；泳道1-8依次对应10⁵fg、10⁴fg、10³fg、10²fg、10¹fg、5fg、1fg与0.1fg；图7a为大肠杆菌o157:h7基因组dna敏感性分析的pcr-age结果图；图7b为大肠杆菌o157:h7基因组dna敏感性分析的rpa-age结果图；图7c为大肠杆菌o157:h7基因组dna敏感性分析的rpa-lfd结果图，c为对照线，t为检测线。

图8：本发明方法中人工染菌牛奶的检测限结果图。图中，泳道m为dnamarker，泳道1-8依次对应4.4×10⁷cfu/ml、4.4×10⁶cfu/ml、4.4×10⁵cfu/ml、4.4×10⁴cfu/ml、4.4×10³cfu/ml、4.4×10²cfu/ml、4.4×10¹cfu/ml与4.4×100cfu/ml，泳道9为无污染生鲜奶对照；图8a为人工染菌牛奶的pcr-age检测限结果图；图8b为人工染菌牛奶的rpa-age检测限结果图；图8c为人工染菌牛奶的rpa-lfd检测限结果图，c为对照线，t为检测线。

具体实施方式

重组酶聚合酶扩增技术(rpa)是一种由多种酶和蛋白参与、在恒温条件下实现核酸指数扩增的等温扩增新技术。rpa通过模拟dna体内扩增，可在37-42℃的等温条件下30min内可产生检测水平的dna拷贝。横向流动试纸条(lfd)，融合了免疫层析与分子生物学技术，可在纸条上形成有颜色的检测线从而实现快速地检测出目标产物。重组酶聚合酶扩增技术(rpa)与侧流层析试纸条(lfd)相结合(rpa-lfd)，可实现rpa扩增产物现场检测可视化，检测结果明显直观，且无设备及技术限制，非常适合食源性致病性大肠杆菌o157:h7的现场快速检测，能对突发状况作出迅速准确判断。然而，在实际应用中发现如果没有有效的引物和探针组合，常会导致检测过程中出现假阳性或检测灵敏度低下的问题。

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、引物筛选与标记

1、rpa引物设计

根据大肠杆菌o157:h7rfbe基因(genbankno：s83460.1)，通过blast分析保守区域，设计rpa引物，上下游引物分别设计4条，并对7种不同上下游引物组合进行pcr与rpa双重筛选，引物组及其序列信息如下：

第1组(eo1)

上游引物eof1：

5’-gcccagttagaacaagctgatgattttatatcacg-3’(seqidno.1)

下游引物eor1：

5’-ccttgtttcgatgagtttatctgcaaggtgattcc-3’(seqidno.2)

产物长度：207bp

第2组(eo2)

上游引物eof2：

5’-catccatgtgatatggaacaaattgtagaactggc-3’(seqidno.3)

下游引物eor2：

5’-cccacatatttacctttatatttagaaccaaaggc-3’(seqidno.4)

产物长度：110bp

第3组(eo3)

上游引物eof3：

5’-ccccattttcgttgattcagataatgaaacttggc-3’(seqidno.5)

下游引物eor2：

5’-cccacatatttacctttatatttagaaccaaaggc-3’(seqidno.4)

产物长度：218bp

第4组(eo4)

上游引物eof4：

5’-tcttcatttagctttgttagcgttaggtatatcgg-3’(seqidno.6)

下游引物eor2：

5’-cccacatatttacctttatatttagaaccaaaggc-3’(seqidno.4)

产物长度：327bp

第5组(eo5)

上游引物eof3：

5’-ccccattttcgttgattcagataatgaaacttggc-3’(seqidno.5)

下游引物eor3：

5’-ccatatcacatggatgtccgtataaatggacacac-3’(seqidno.7)

产物长度：125bp

第6组(eo6)

上游引物eof4：

5’-tcttcatttagctttgttagcgttaggtatatcgg-3’(seqidno.6)

下游引物eor3：

5’-ccatatcacatggatgtccgtataaatggacacac-3’(seqidno.7)

产物长度：233bp

第7组(eo7)

上游引物eof4：

5’-tcttcatttagctttgttagcgttaggtatatcgg-3’(seqidno.6)

下游引物eor4：

5’-ccaagtttcattatctgaatcaacgaaaatggggg-3’(seqidno.8)

产物长度：142bp

2、引物的pcr

pcr反应体系(25μl)

备注：eof、eor分别为7组引物的上下游引物，模板为大肠杆菌o157:h7基因组dna。

pcr反应在核酸扩增仪中进行，pcr反应程序：首先，95℃预变性5min；然后，进入30个循环，每个循环95℃变性25s，55℃退火25s，72℃延伸45s；最后，72℃再延伸10min。

3、引物的rpa

(1)rpa反应体系(10μl)

(2)rpa反应

将上述除醋酸镁溶液外的试剂依次加入无菌离心管中，充分混匀，接着，将醋酸镁溶液加在无菌离心管管盖内部，盖紧后瞬时离心，离心后混匀迅速放入关闭热盖的pcr仪或40℃恒温水浴中孵育10min。

4、pcr与rpa产物的电泳检测

pcr与经pcr产物纯化试剂盒纯化后rpa产物进行琼脂糖凝胶电泳(age)分析。如图1所示，第6组引物对应的rpa电泳条带较亮且无非特异性扩增，说明在相同反应条件下，第6组引物的rpa扩增效果明显优于其他6组引物。

5、引物标记

将第6组引物eo6(eof4/eor3)作为本发明rpa反应的最佳引物对，对下游引物eor3的5’端应用生物素biotin标记。

实施例2、rpa-lfd建立

1、探针设计

针对最佳引物对eof4/eor3设计探针eoprob：5’-fam-tgtctgttagtgacatagaacaaaaaatcact-thf-ataaaactaaagctatt-c3-spacer-3’(seqidno.9)(图2)。

探针长度：49bp

对应rpa产物长度：233bp

2、rpa反应体系(10μl)

3、rpa反应体系扩增

将上述除醋酸镁外的试剂加入无菌离心管中，充分混匀。接着，将醋酸镁溶液加在无菌离心管管盖内部，盖紧后瞬时离心，离心后混匀迅速放入关闭热盖的pcr仪或40℃恒温水浴中孵育10min。

4、rpa产物的lfd检测

取2μlrpa产物加入含有100μltris-clbuffer(ph8.0)的96孔微孔板中混匀，然后将lfd试纸条样品加样区一端垂直浸入上述缓冲溶液中显色5min，通过试纸条显色情况判定结果：(1)含有fam与biotin双抗原标记的rpa产物与lfd上金标记抗fam抗体结合后，可被检测线(t)上包被的抗biotin抗体以及控制线(c)上抗金标记抗fam抗体二抗捕获，t线与c线均呈红色，结果判定为阳性；(2)仅含有biotin标记的下游引物或仅含有fam标记的探针或其他不含有fam/biotin双标记的无关产物则只能被c线上包被的抗金标记抗fam抗体二抗捕获，只有c线呈红色，结果判定为阴性；(3)金标记抗fam抗体没有与c线上的抗金标记抗fam抗体二抗结合，c线不显色，结果判定为无效。

实施例3、rpa反应条件优化

对大肠杆菌o157:h7rpa的rpa最佳反应体积、最佳反应时间与最佳反应温度进行摸索。rpa反应体积设定10个梯度：5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl与50μl，每个反应体积对应的rpa反应成分含量与其体积为等比例构成。rpa反应在恒温电热水浴锅中进行，不同反应体积对应的rpa产物纯化后通过2％age和lfd进行分析。结果如图3所示，rpa扩增产物量在rpa反应体积为5μl时最低，在10μl到30μl的9个梯度基本保持不变。rpa反应时间设定6个梯度：5min、10min、15min、20min、25min与30min，rpa反应体系除了时间不同外，其余均相同。rpa反应在恒温电热水浴锅中进行，不同反应时间对应的rpa产物纯化后通过2％age和lfd进行分析。结果如图4所示，rpa扩增产物量在rpa反应时间为5min时最低，在10min到30min的5个梯度基本保持不变。rpa反应温度设定6个梯度：37℃、38℃、39℃、40℃、41℃与42℃，rpa反应体系除了温度不同外，其余均相同。rpa反应在关闭热盖的温度梯度pcr仪中进行，不同反应温度对应的rpa产物通过2％age和lfd进行分析。结果如图5所示，rpa扩增产物量在rpa反应温度为40℃时达到最大值。综上可知，大肠杆菌o157:h7的rpa在反应体积为10μl，反应时间为10min，反应温度为40℃情况下，rpa产物量可达最大值，反应效果最好。说明rpa反应在10μl微小体积可在10min内完成，反应经济、迅速，这种优势非常适用于快速检测。

实施例4、特异性分析

以含有大肠杆菌o157:h7特异基因rfbe的重组质粒rpucm-rfbe(阳性对照)以及大肠杆菌o157:h7、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌与空肠弯曲杆菌的基因组dna作为rpa反应模板，模板量为0.1ng，对建立的rpa-lfd检测方法进行特异性分析，同时以ddh2o作为空白对照。rpa反应体系如前所述，rpa体系在40℃下反应10min，rpa扩增产物通过age和lfd进行双重分析评估(图6)。结果显示，rpa以阳性对照质粒以及大肠杆菌o157:h7基因组dna为模板可进行有效扩增，而以其他细菌基因组dna为模板进行的扩增均为阴性结果。由此可见，本发明rpa-lfd可实现对大肠杆菌o157:h7的特异性检测，不与其它相关食源性致病菌发生交叉反应，说明本发明具有很强的特异性。

实施例5、敏感性分析

在最佳的rpa反应条件下，以大肠杆菌o157:h7不同量基因组dna(10⁵fg、10⁴fg、10³fg、10²fg、10¹fg、5fg、1fg、0.1fg)为模板，进行rpa-lfd敏感性分析，同时以rpa-age和pcr-age作为平行对照。结果如图7所示，rpa-lfd，rpa-age与pcr-age分别可检出1fg，5fg与100fg的大肠杆菌o157:h7基因组dna。不难看出，rpa-lfd的敏感性分别是rpa-age与pcr-age方法的5倍与100倍。因此，针对大肠杆菌o157:h7基因组dna，本发明rpa-lfd具有极高的灵敏度。

实施例6、实际应用

1、生鲜奶人工染菌

在对生鲜奶进行人工污染前，按照国标法(gb4789.3-2016)检验生鲜奶中不含大肠杆菌o157:h7。取200μl经平板计数的大肠杆菌o157:h7的原液4.4×10⁸cfu/ml加入到1.8ml的生鲜奶中混匀，接着依次向后作10倍倍比稀释直至大肠杆菌o157:h7菌液终浓度达到4.4×10⁰cfu/ml，最终使生鲜奶中含菌量介于4.4×10⁷cfu/ml-4.4×10⁰cfu/ml(共8个梯度)。对应每个稀释度的大肠杆菌o157:h7的基因组dna应用商品化基因组dna抽提试剂盒进行抽提。

2、人工染菌牛奶rpa-lfd检测限

以不同稀释度(4.4×10⁷cfu/ml-4.4×10⁰cfu/ml)大肠杆菌o157:h7基因组dna为模板，对pcr-age、rpa-age以及rpa-lfd的检测限进行分析。结果如图8所示，rpa-lfd与rpa-age对于人工污染生鲜奶中大肠杆菌o157:h7的检测限均为4.4cfu/ml，比pcr-age(4.4×10²cfu/ml)高100倍。由此可见，rpa-lfd对于染菌牛奶中大肠杆菌o157:h7检测具有极高的灵敏度，说明rpa-lfd技术在食源性致病菌检测领域具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明最佳实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>郑州轻工业学院

<120>一种用于检测致病性大肠杆菌o157:h7的rpa-lfd引物对和探针及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

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