本发明属微生物技术领域，特别是涉及3种紫花玉簪内生真菌醇提物的制备及其应用。
背景技术：
紫花玉簪（hostaventricosa）属百合科（liliacea）玉簪属（hosta）多年生宿根草本植物，主要分布于海拔500～2400m的亚洲温带，亚热带地区，原产于中国，韩国和日本。其全草均可入药，是一种蒙医药学传统常用药材，其中玉簪花主治疔疮，蛇虫伤等，玉簪叶主治咽喉疼痛，小便不适，烧伤等，玉簪根消除肿痛、解除毒素等。人类多种心血管疾病均与氧自由基有关，然而合成抗氧化剂均存在一定的毒性，从天然产物中寻找高效、低度抗氧化剂已成为一个必然趋势。据相关报道，蒙药玉簪具有抗氧化作用、能改善抗氧化酶在机体中的活力等。申请者根据宿主植物与其内微生物在长期共同生活而具有产生相同活相似次生代谢产物合成途径的“内共生理论”，从紫花玉簪中分离筛选到具有较强抗氧活性的内生真菌，相关研究未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是从紫花玉簪中分离筛选出提取物有抗氧化活性的内生真菌，并将该提取物应用于抗氧化药物。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
紫花玉簪内生真菌醇提物的抗氧化活性及其应用，所述提取物通过以下制备方法制得：
（1）采集新鲜健康紫花玉簪根部；
（2）将步骤（1）紫花玉簪根部组织表面消毒后，做超净工作台洁净度检查，漂洗液检查，植物组织印记法筛选无菌组织块；
（3）将步骤（2）的无菌组织于无菌工作台切成小块，置于pda培养基中，于恒温真菌培养箱中倒置培养，待出现内生真菌菌丝沿组织切口向外生长时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经反复纯化后转接到pda斜面培养基，备用；
（4）将新鲜马铃薯洗净去皮后切成小块，加蒸馏水煮沸，用纱布过滤，滤液中加入葡萄糖搅拌均匀，用蒸馏水稀释、分装、灭菌，制得液体发酵培养基；
（5）将步骤（4）液体发酵培养基分装在锥形瓶中，用打孔器将经步骤（3）分离纯化的内生真菌打入菌饼于锥形瓶中，恒温培养、烘干后碾碎，将菌丝体进行乙醇超声提取，提取液浓缩干燥，即得提取物。
具体实施方式包括以下步骤：
（1）紫花玉簪组织的准备：采集新鲜健康紫花玉簪根部；
（2）紫花玉簪组织的表面消毒与无菌检测：将步骤（1）紫花玉簪根部组织表面消毒后，做超净工作台洁净度检查，漂洗液检查，植物组织印记法筛选无菌组织块；
（3）紫花玉簪内生真菌的分离培养：将步骤（2）的无菌组织于无菌工作台切成直径为0.5cm左右的小块，置于pda培养基中，于25℃恒温真菌培养箱中倒置培养，待出现内生真菌菌丝沿组织切口向外生长时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经反复纯化后转接到pda斜面培养基，备用；
（4）内生真菌液体发酵培养基的配置：将新鲜马铃薯洗净去皮后切成小块，称取200g，加蒸馏水1000ml煮沸30min，用4层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖（20g）搅拌均匀，用蒸馏水补足1000ml，分装至250ml锥形瓶中装量100ml，121℃条件下灭菌30分钟；
（5）内生真菌菌丝体醇提物制备：将步骤（4）液体发酵培养基分装在250ml锥形瓶中，装量100ml，用打孔器将经步骤（3）分离纯化的内生真菌打入直径为6mm的菌饼于锥形瓶中，25℃，170r/min培养15d，菌丝体60℃烘干后碾碎，将菌丝体按1:30料液比加入75%乙醇超声提取30min，提取液60℃真空浓缩干燥，即得提取物。
抗氧化活性的菌株筛选：将所得提取液以总抗氧化能力，dpph和abts+自由基清除能力为指标，从中筛选出抗氧化活性菌株备用。
附图说明：
图1：hov1、hov4、hov8系统发育树。
图2：菌丝体乙醇提取物抗氧化活性综合。
图3：菌丝体乙醇提取物dpph自由基清除活性。
图4：菌丝体乙醇提取物abts+自由基清除活性具体实施方式。
下面结合实施例对本用途发明作进一步描述。
实例1：紫花玉簪内生真菌hov1，hov4，hov8的典型分离
1.植物样本采集：新鲜健康的紫花玉簪根茎采至四川农业大学成都校区，流水下冲洗12h，6%的次氯酸钠漂洗25s，无菌滤纸吸干表面液体，无菌水漂洗3次，吸干表面液体进行表面消毒。表面消毒后做超净工作台洁净度检查，漂洗液检查，植物组织印记法筛选无菌组织块。
2.内生真菌的分离纯化：在无菌工作台，将上述无菌组织切成直径为0.5cm左右的小块，置于pda培养基中，于25℃恒温真菌培养箱中倒置培养，待出现内生真菌菌丝沿组织切口向外生长时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经反复纯化直到同种内生真菌菌落形态一致且每皿只有一种内生真菌生长时说明纯化完成，记录并将菌落编号，斜面保存。
3.总dna的提取：将分离纯化的内生真菌hov1，hov4，hov8接种于pda培养基中，于25℃恒温真菌培养箱中倒置培养7d，总dna的提取采用omega试剂盒及相关操作说明：①称取100mg新鲜样品至2mlep管中，加500μlbuffercpl，10μl巯基乙醇，混匀后65℃静置15min；②加500μl氯仿-异戊醇（24：1），混匀，10000r/min离心5min，吸取300μl上清液于吸附柱中；③在上清液中加入150μlbuffercxd和300μl无水乙醇，混匀，10000r/min离心1min，弃废液；④向吸附柱中加入650μlspwwashbuffer，10000r/min离心1min，弃废液；⑤重复以上步骤；⑥12000r/min离心2min，吸附柱置于50℃静置3min；⑦将吸附柱转入离心管中，中央悬空滴加50μl经65℃水浴预热的elutionbuffer，室温放置2min，10000r/min离心lmin。⑧离心所得洗脱液即为基因组dna。
4.菌株hov1，hov4，hov8的its序列扩增：采用真菌扩增通用引物ist1(5'-tccgatggtgaacctgcgg-3’)和ist4（5'-tcctccgcttattgatatgc-3’）扩增内部转录区间序列，反应体系如下：
dna模板1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、pcrmix12.5μl、ddh2o9.5μl。
pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃低温保存。
5.pcr反应产物确认：取5μlpcr产物与1μldnagreen染料混合后点样于1.2%琼脂糖凝胶，110v条件下电泳15min，于凝胶成像系统中观察条带，如出现500bp左右条带，则初步判断扩增成功。
6.pcr反应产物测序：将pcr产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。
7.数据分析：将菌株hov3、hov7的序列用blast比对与genbank中的序列进行同源性比对，并采用clustalx2.0做同源性比较和匹配排序，用mga5构建邻接(neighborjoining,nj)树，根据系统发育树中组群关系，进行系统发育分析。实验结果见图1：
由图1可知，菌株hov1和hov8与fusariumoxysporum(jq301898.1)、fusariumoxysporum(ku321554.1)聚为一分支，支持率为100，序列同源性高于99%，确定菌株hov1、hov8为尖孢镰刀菌属(fusariumoxysporum)。菌株hov4与epicoccum(kp721576.1)聚为一分支，支持率为100，序列同源性高于99%，确定菌株hov4为附球菌属(epicoccum)。
实施例2：紫花玉簪内生真菌hov1，hov4，hov8菌丝体醇提物抗氧化活性测试
1.菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的真菌接种到pda培养基中，置于25℃真菌恒温培养箱中培养7d，活化，在活化好的菌落周围挑取菌丝体接种到pda培养基中，置于25℃真菌培养箱中培养7d，使真菌恢复正常长势。
2.紫花玉簪内生真菌hov1，hov4，hov8发酵产物制备：将菌株接种于pda平板上，25℃培养7d。于工作台中，用打孔器沿菌落边缘打直径为6mm的菌饼，接种至含100mlpdb培养基的250ml锥形瓶中；25℃，170r/min培养15d，待菌丝体将培养液液面全部覆盖后，终止发酵，同时留一瓶未接种的作为空白对照。发酵液用4层纱布过滤，将菌丝体和发酵液分离，菌丝体60℃烘干后碾碎。
3.hov1，hov4，hov8菌丝体醇提物制备：准确称取已经烘干制备的菌丝体1.0g于50ml锥形瓶中，按1:30料液比加入75%乙醇超声提取30min，重复3次合并提取液，提取液用微孔滤膜（0.22μm）过滤后，60℃真空浓缩干燥，4℃保存备用
4.总抗氧化（t-aoc）活性测定：总抗氧化活性测定采用南京建成生物工程研究所总抗氧化能力(t-aoc)测定试剂盒检测。
5.dpph自由基清除活性测定：具塞试管中加入1mldpph（2×10-4mol/l）和1ml样品溶液（23.44-750.00μg/ml）混匀后于室温，黑暗条件下反应30min，并在517nm测定吸光度。
清除率=（1-(ai-aj)/ac）×100%
其中ai为dpph与样品反应后的吸光度，aj为样品溶液吸光度，ac为溶剂吸光度。
6.abts+自由基清除活性测定：于试管中将0.2ml样品（4.68-300.00μg/ml）与0.8mlabts+工作液混匀后于室温，黑暗条件下反应10min，并在734nm测定吸光度，以上试验均重复3次。
清除率=(a0-a)/a0×100%
其中a0是空白吸光度，a是abts+工作液与样品反应后的吸光度。
实验结果：
1.总抗氧化活性：
如图2结果所示，3株内生真菌菌丝体乙醇提取物均表现出不同程度的总抗氧化活性，其中hov4具有明显的总抗氧化活性，总抗氧化活性达到66.05±0.71u/g，但低于同浓度的bht（349±0.71u/g），其次为hov1（63.46±0.26u/g），hov8（48.89±0.01u/g）。
2.dpph自由基清除活性：
从图3可以看出紫花玉簪根部内生真菌hov1，hov4，hov8菌丝体提取物均对dpph自由基有不同程度的清除能力，在23.44～750μg/ml都显示出明显的剂量依赖性。其中，hov8（ec50=16.02μg/ml）菌丝体乙醇提取物表现出极强的dpph自由基清除活性，强于bht(ec50=28.68μg/ml)。当其在浓度为375μg/ml时，其清除活性可达96.2％，高于同浓度下bht。从图2可以看出除hov8外，其次分别为hov4（ec50=59.13μg/ml），hov1（ec50=83.42μg/ml）
3.abts+自由基清除活性：
图4反应出紫花玉簪根部内生真菌hov1，hov4，hov8清除abts+自由基活性，3株内生真菌菌丝体醇提物均在4.68～300μg/ml表现出明显的剂量依赖性。从图2可以看出其中hov4具有最低的ec50=24.66μg/ml，但高于bht（ec50=8.86μg/ml）。
综上所述，hov1（镰刀菌属）和hov4（附球菌属）表现出更强的综合抗氧化能力，具有较高的总抗氧化活性和较强的dpph自由基和abts+自由基清除能力；hov8（镰刀菌属）显示出优异的dpph自由基清除活性，优于同浓度的下的bht。它们均有望被开发成为天然抗氧化制剂。
实施例3：制剂试验：
产品含5%的hov1，hov4，hov8菌丝体醇提物，加入2%的钠皂作为乳化剂，加入1%的芳香剂，制备抗氧化乳膏剂。